Effect of crowdedness in the life cycle of lysenin studied by high-speed atomic force microscopy

par Ignacio Lopez de Blas

Thèse de doctorat en Biochimie structurale

Sous la direction de Simon Scheuring.

Le président du jury était Alain Roussel.

Le jury était composé de Ignacio Casuso.

Les rapporteurs étaient Ana Jesus Garcia Saez, Bart Hoogenboom.


  • Résumé

    De nombreuses fonctions de la membrane plasma dépendent de manière vitale de sa structure et de sa dynamique. L’observation d’une diffusion anomale in vivo et in vitro par l’utilisation de la microscopie en fluorescence et par le pistage de particules Isolées ont permis de développer notre conception de la membrane, en la faisant passer d’un fluide homogène à deux couches avec des protéines se diffusant librement, à une mosaïque extrêmement organisée, surpeuplée et agglomérée de lipides et de protéines. Malheureusement, il n’a pas été possible d’apparenter les diffusions anomales à des détails moléculaires en raison du manque de capacité d’observation moléculaire directe et unmarqués Dans cotre cas, nous utilisons la microscopie à force atomique à grande vitesse, et une méthodologie d’analyse innovante pour analyser le pore en formant la protéine Lysine dans un environnement surpeuplé et nous documentons l’existence de différents régimes de diffusion au sein de la même membrane. Nous montrons la formation de phases locales de verre, où les protéines sont attrapées dans des cages formées par proximité cages sur des échelles de temps allant jusqu’à 10 s, ce qui n’avait pas été antérieurement observé de manière expérimentale pour les membranes biologiques. De plus, autour de patchs d’apparence solide et de molécules immobiles nous avons pu détecter une phase du verre plus lente qui mène à l’emprisonnement de la protéine et à la création d’un périmètre de diffusion de la membrane diminué .


  • Résumé

    Many functions of the plasma membrane depend critically on itsstructure and dynamics. Observation of anomalous diffusion in vivo and in vitro usingfluorescence microscopy and single particle tracking has advanced our concept of themembrane from a homogeneous fluid bilayer with freely diffusing proteins to a highlyorganized crowded and clustered mosaic of lipids and proteins. Unfortunately,anomalous diffusion could not be related to local molecular details given the lack ofdirect and unlabeled molecular observation capabilities. Here, we use high-speedatomic force microscopy and a novel analysis methodology to analyze the poreforming protein lysenin in a highly crowded environment and document coexistenceof several diffusion regimes within one membrane. We show the formation of localglassy phases, where proteins are trapped in neighbor-formed cages for time scales upto 10 s, which had not been previously experimentally reported for biologicalmembranes. Furthermore, around solid-like patches and immobile molecules aslower glass phase is detected leading to protein trapping and creating a perimeter ofdecreased membrane diffusion.


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