Les microARN et la fonction gonadotrope hypophysaire

par Jérôme Lannes

Thèse de doctorat en Physiologie et biologie des organismes, populations, interactions. Génomes, épigénomes et destin cellulaires

Sous la direction de Bruno Quérat.

Soutenue le 20-10-2016

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris) , en partenariat avec Unité de biologie fonctionnelle et adaptative (Paris) (équipe de recherche) et de Université Paris Diderot - Paris 7 (établissement de préparation) .

Le président du jury était Nicolas De Roux.

Le jury était composé de Daniel Vaiman, Sylvie Dufour.

Les rapporteurs étaient Vincent Prévot, Michele Trabucchi.


  • Résumé

    Mon travail de thèse s’est focalisé sur l’étude du rôle des miARN comme modulateurs de l’expression des gonadotropines en réponse à un traitement par la GnRH. Dans un premier temps, nous avons étudié les miARN-132 et -212 fortement induits en réponse à la GnRH dans les cellules gonadotropes. Nous démontrons que l’induction de la production de FSH par la GnRH est dépendante de l’activation des miR-132/212 dans les cellules hypophysaires de rat et dans la lignée cellulaire gonadotrope LβT2. Nous montrons à l’aide de cette lignée que l’élévation de miR-132/212 inhibe l’expression de la lysine déacétylase SIRT1, favorisant ainsi l’acétylation inhibitrice d’un répresseur transcriptionnel de la FSH, conduisant donc à l’activation de l’expression de la FSH (Lannes et al, 2015). J’ai ensuite étudié l’action d’un miARN fortement inhibé en réponse à la GnRH, miR-125b. Nous démontrons que miR-125b bloque la signalisation Gαq/11 en réprimant plusieurs effecteurs de cette voie, sans réguler la voie Gαs. Lors de l'exposition à la GnRH, miR-125b est inactivé par transfert d’un groupement méthyle par l’ARN méthyltransférase NSun2, activée par phosphorylation Gαs/PKA-dépendante. Nous observons que l’induction demiR-132 et de la phosphatase PP1α en réponse à la GnRH dépend de la voie Gαq/11 et est induite par l’inactivation de miR-125b. Nous démontrons que NSun2 est une cible de miR-132 et que la phosphorylation de NSun2 est supprimée par la phosphatase PP1α. Des analyses cinétiques nous ont permis de décrypter le mécanisme de désensibilisation à la stimulation GnRH. Lors de la phase d’induction par la GnRH, l’activation de la voie Gαs/PKA inactive miR-125b permettant une levée d’inhibition de la voie Gαq/11 et par là, l’induction des gènes des gonadotropines, de miR-132 et PP1α. L’activation de ces derniers contribue à l’inactivation de NSun2 et à un retour de miR-125b à son état d'équilibre permettant de nouveau l’inhibition de la voie Gαq/11 et donc de l’expression des gonadotropines (Lannes et al, 2016). Notre étude montre pour la première fois le rôle crucial d’une boucle de régulation entre deux miARN dans le mécanisme de la désensibilisation de la réponse à la GnRH. Le caractère ubiquitaire des acteurs de cette boucle de régulation laisse penser qu’elle pourrait jouer un rôle plus général. Les travaux complémentaires effectués montrent que la GnRH induit la sécrétion de plusieurs miARN. In vitro, nous avons démontré que la GnRH provoque une libération calcium-dépendante de miR-125b et de miR-132 dans le milieu extracellulaire par les cellules gonadotropes. In vivo, nous mettons en évidence chez la rate et la femme, une augmentation sérique des miARN-125b et -132 au moment de la décharge ovulante de LH induite par la GnRH. Ces résultats suggèrent que la cellule gonadotrope hypophysaire est capable d’émettre un message original, sous la forme de miARN, dans la circulation sanguine. Mes travaux de thèse éclairent le rôle clé joué par les miARN dans la réponse de la cellule gonadotrope à la stimulation prolongée à la GnRH. Ils mettent en évidence l’effet bloquant d’un seul miARN, miR-125b sur la signalisation liée à la protéine Gαq/11, une voie activée par nombre de récepteurs. Ils révèlent l’existence d’une boucle de régulation responsable de la désensibilisation à la GnRH mais qui pourrait être plus largement répandue. Enfin, la sécrétion des miARN dans la circulation sanguine induite par la GnRH que nous mettons en évidence pour la première fois ouvre des perspectives particulièrement intéressantes sur la nature du signal généré par les cellules gonadotropes et permet d’envisager l’existence de nouveaux tissus cibles.

  • Titre traduit

    MicroRNA and hypophyseal gonadotrope function


  • Résumé

    GnRH is a hypothalamic neurohormone that stimulates synthesis and release of the pituitary gonadotropins, LH and FSH. Mammalian GnRH receptor lacks a C-terminal tail and is thus not submitted to homologous desensitization. Desensitization of gonadotrope cells to sustained exposure to GnRH relies on post-receptor mechanisms operating at different levels of the Gαq/11-mediated signalling pathway. GnRH was shown to modulate the expression of microRNAs (miRNAs), a new class of signalling regulators composed of small single-stranded RNAs that regulate gene expression at a post-transcriptional level. The purpose of my PhD thesis was to investigate the role of miRNAs in contributing to the regulation of gonadotrope cells by GnRH and notably to its desensitization effect. I first demonstrated that a GnRH-induced rise in miR-132 and miR-212 in rat primary pituitary culture cells and in the LβT2 murine gonadotrope cell line was necessary for efficient stimulation of FSH production. We then showed that the miR-132/212-mediated action of GnRH involved a posttranscriptional decrease of SIRT1, a lysine deacetylase. The lower level of SIRT1 allowed an increase in the acetylated form of FOXO1, a transcriptional repressor of Fshb, leading to its exit from the nucleus and to an increase in FSH expression (Lannes et al, 2015). Then, I focussed on the involvement of miR-125b, a miRNA that was strongly inhibited in response to GnRH. We showed that miR-125b blocked the Gαq/11 signalling pathway, through the repression of several effectors of this pathway, without affecting the Gαs signalling pathway. Upon exposure to GnRH, miR-125b was inactivated by methylation on adenosine by the NSun2 RNA methyltransferase. This later enzyme was activated by a Gαs/PKA-dependent phosphorylation. We observed that the induction of miR-132 and PP1α phosphatase in response to GnRH depends on a Gαq/11 activation allowed by the inactivation of miR-125b. We demonstrated that NSun2 is a target of miR-132 and that phosphorylation of NSun2 is suppressed by PP1α. Kinetic analyses enabled us to decipher the desensitization mechanism to GnRH stimulation. During the induction phase, the Gαs/PKA activation led to lower miR-125b levels, allowing Gαq/11 signalling and hence, transcriptional activation of gonadotropins genes. Co-activation of miR-132 and PP1α contributed to the inactivation of NSun2 and a return of miR-125b back to its equilibrium state leading to Gαq/11 signalling inhibition and therefore, to the arrest of gonadotropins expression (Lannes et al, 2016). Our study shows for the first time the crucial role of a miRNAs regulatory loop in the GnRH-induced mechanism of desensitization. The ubiquitous nature of the actors of this regulatory loop suggests that it may play a more general role. Additional works carried out showed that GnRH induces the secretion of several miRNAs. In vitro, we demonstrated that the GnRH causes a calcium-dependent release of miR-125b and miR-132 in the extracellular medium by the gonadotrope cells. In vivo, we highlighted a miRNA-125b and -132 increase in serum at the time of the ovulating LH surge induced by GnRH in rats and women. These results suggest that the pituitary gonadotropic cell is capable of transmitting an original message in the form of miRNA, into the bloodstream. My PhD work unravels the key role played by miRNAs in the gonadotrope cells response to GnRH-sustained stimulation. They highlight the blocking effect of a single miRNA, miR-125b on the Gαq/11 signalling, a pathway activated by many other membrane receptors. They indicate the existence of a regulation loop responsible for the desensitization to GnRH but which could be more widespread. Finally, the secretion of miRNAs in blood flow induced by the GnRH that we show for the first time opens up particularly interesting perspectives on the nature of the signal generated by the gonadotrope cells and allows to consider the existence of new target tissues.

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