Effect of CyaA acylation on its folding and membrane properties

par Sara Elisabetta Cannella

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Biophysique et Biochimie

Sous la direction de Alexandre Chenal.

Soutenue le 27-09-2016

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris) , en partenariat avec Unité Biochimie des interactions macromoléculaires (Paris) (laboratoire) et de Université Paris Diderot - Paris 7 (établissement de préparation) .

Le président du jury était Claudine Mayer.

Le jury était composé de Marie Galloux, Bertrand Friguet.

Les rapporteurs étaient Michel Desmadril, Sonia Longhi.

  • Titre traduit

    Effet de l’acylation de CyaA sur son repliement et son interaction avec les membranes


  • Résumé

    L’Adénylate cyclase (CyaA), produite par B. pertussis, agent responsable de la coqueluche, est un des principaux facteurs de virulence de la bactérie. La toxine est une grande protéine multi-domaine qui est synthétisée comme un précurseur inactif, proCyaA. Ce précurseur est converti dans la forme active après une acylation spécifique. Après la sécrétion, la toxine envahir les cellules eucaryotes par un mécanisme unique qui implique la translocation de son domaine catalytique dans le cytosol des cellules eucaryotiques. Cette mécanisme est toujours pas clair et nombreuses questions restent ouvertes. Dans la présente étude, nous avons étudié les propriétés structurales et fonctionnelles des différentes espèces de (pro)CyaA en solution et inséré dans la membrane. Nous avons observé que le repliement de (pro)CyaA dans la forme monomérique dépend de la présence de calcium et de l'acylation post-traductionnelle. En outre, nous avons observé que la présence du calcium améliore fortement la stabilité de la protéine. De plus, nous avons identifié un segment hydrophobe dans CyaA, mais pas dans proCyaA, qui intervient dans les premières étapes du repliement de la protéine. L'analyse macroscopique a révélé que CyaA est plus stable et compacte par rapport à proCyaA. Nous avons aussi observé que les deux toxines sont capables de perméabiliser les membranes in vitro, mais que seulement la toxine monomérique et acyle est capable d'exercer des activités de membranes efficaces dans la cellule (hémolyse, translocation de AC et production de cAMP). Nous proposons que la toxine monomérique est la seul espèce compétent et fonctionnel.


  • Résumé

    Adenylate cyclase is one of the major virulence factors produced by Bordetella pertussis, the causative agent of whopping cough. The toxin is a huge multi-domain protein synthesized as an inactive precursor, proCyaA, which is converted into the active form upon a specific acylation. Once secreted across the bacterial cell envelope, the toxin invades eukaryotic cells through a unique mechanism that involves the direct translocation of its catalytic domain inside the cytosol of the target cells. This mechanism is still not clear and many questions remain open. In the present study we investigated the structural and functional properties of various (pro)CyaA species in solution and upon membrane-insertion. We found that the (re)folding of CyaA into a monomeric form critically depend upon the presence of calcium and the post-translational acylation. We observed that calcium binding strongly improves the stability of the protein. Moreover we identified a hydrophobic segment in CyaA, but not in proCyaA, which is involved in the early stages of the refolding process. Macroscopic analysis showed that CyaA is more stable and compact as compared to proCyaA. We also observed that both toxins are able to permeabilize membranes in vitro, although only the monomeric and acylated toxin is able to exert efficient membrane activities in cellula (i.e., hemolysis, AC translocation and cAMP production). We propose that the monomeric species is the functional competent and active state and that the acyl chains play not only a structural role but are also essential for the functional activities of the toxin.



Le texte intégral de cette thèse sera accessible librement à partir du 27-09-2021

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