Etude de la Ribonuclease J de Chlamydomonas reinhardtii

par Anna Danuta Lipońska

Thèse de doctorat en Microbiologie procaryote et eucaryote

Sous la direction de Harald Putzer.

Soutenue en 2016

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris) , en partenariat avec Université Paris Diderot - Paris 7 (autre partenaire) .


  • Résumé

    Nous avons surproduit et purifié différentes formes de la RNase J de Chlamydomonas reinhardtii (CrRNase J). Nous avons testé les protéines dans un test d'activité avec la séquence de l'ARN "leader" de thrS. Cet ARN a permis de mettre en évidence aussi bien l'activité 5' exonucléolytique que l'activité endonucléolytique de la RNase J de B. Subtilis. Nous avons alors mis en évidence une activité endonucléolytique pour les différentes constructions de la CrRNAse J, mais une activité 5'-3'exonucléolytique très faible. Pour confirmer ce résultat, nous avons testé si la CrRNase J, pouvait compenser in vivo l'absence des RNases J de B. Subtilis (BsRNase J). Nous avons constaté que la CrRNase J n'était pas capable de compenser la perte de la RNase JI de B. Subtilis. L'absence de complémentation de la RNase. 11 n'indique pas une absence d'activité 5' exonucléolytique de la CrRNase J. Nous avons décidé de tester l'activité 5' exonucléase in vivo (chez B. Subtilis) sur des substrats pour lesquels cette activité a été bien caractérisée (16S rRNA and glmS). Nous n'avons pas pu observer la moindre activité 5'-3' exonucléolytique pour la CrRNase J in vivo. Nous avons aussi entamé des expériences de double hybride dans la levure (Y2H), dans le but d'identifier les partenaires potentiels de la CrRNase J. Nous avons mis en évidence des partenaires potentiels pour la CrRNase J (NDA3, EF3 ou HP4). Nos résultats montrent que même en présence de ces proteines, indépendamment de la nature du nucléotide à l'extrémité 5' de l'ARN cible ou de la présence d'ions dans le mélange réactionnel, CrRNase J montre seulement une activité endoribonucléolytique.

  • Titre traduit

    RNAse J of Chlamydomonas reinhardtiie


  • Résumé

    We overproduced and purified different forms of RNase J from Chlamydomonas reinhardtii (CrRNase J). Proteins were tested for the presence of endonucleolytic and 5'-3' exonucleolytic activity with the B. Subtilis thrS leader model substrate. This substrate is routinely used to test the double activity of the B. Subtilis RNase J (BsRNase J1). CrRNase J proteins showed high endo- but no significant 5'-3' exonucleolytic activity. The lack of strong exonucleolytic activity in vitro prompted us to verify if CrRNase J could compensate for a deletion of BsRNase J. The expression of CrRNase J had no effect on growth of a wild type strain, but could not compensate for the severe growth defect caused by the lack of BsRNase JI. The absence of complementation of BsRNase J1 is no proof that it is due to the lack of the 5'-3' exonucleolytic activity. We further analysed two well-studied processing/degradation events that require the 5'-3' exonucleolytic activity of the B. Subtilis enzyme (16S rRNA and glmS) in these recombinant strains. We found that CrRNase J was unable to provide the 5' exonuclease activity required for these processes in B. Subtilis. We performed a yeast double-hybrid (Y2H) screen to look for potential partners of the CrRNase J. In this study we tested some of them (FTT2, NDA3, EF3 or HP4), in the in vitro test with CrRNase J. None of those proteins was able to stimulate the 5'-3' exonucleolytic activity of C. Reinhardtii enzyme. Together these results show that, despite our efforts with different substrates, modification of the test system and the presence of potential activating factors, CrRNase J shows only an endoribonucleolytic activity.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (147 p.)
  • Annexes : 186 réf.

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