Activité motrice de myosines dans des réseaux de filaments d’actine d’architecture contrôlée in vitro

par Mathieu Richard

Thèse de doctorat en Biophysique

Sous la direction de Pascal Martin.

Soutenue le 07-10-2016

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris) , en partenariat avec Université Paris Descartes (1970-2019) (établissement de préparation) et de Physico-Chimie-Curie / PCC (laboratoire) .


  • Résumé

    Les moteurs moléculaires permettent le transport actif de molécules et d’organelles le long de filaments polaires du cytosquelette de la cellule eucaryote. Les filaments peuvent s’organiser en réseaux parallèles, antiparallèles, ou désordonnés. Malgré son importance, l’influence de l’architecture du cytosquelette sur le transport de cargos par des moteurs moléculaires est souvent ignorée. Dans ce travail de thèse, nous avons utilisé des patrons surfaciques de nucléation pour contrôler la géométrie de polymérisation de filaments d’actine. Cette approche permet de reproduire in vitro les trois types de réseaux qui sont observés in vivo. En adsorbant des moteurs moléculaires purifiés à la surface de nano-billes fluorescentes (diamètre 200 nm), nous avons étudié le transport de ces cargos dans des réseaux antiparallèles émergeant de deux lignes de nucléation parallèles. Nous avons observé que les billes recouvertes de moteurs processifs HMM-V (Heavy Mero-Myosine V) génèrent des mouvements dirigés en direction du milieu du réseau où la polarité moyenne des filaments est nulle et où les billes s’accumulent. De plus, la distribution de positions des billes à l’état stationnaire peut être déduite des profils de vitesse et de diffu-sion des billes, indiquant que le transport actif suit un processus de convection-diffusion. Les billes recouvertes de moteurs non-processifs HMM-II (Heavy Mero-Myosine II) dé-montrent des comportements similaires. Cependant, bien que le gradient de vitesse des billes HMM-II soit plus important que pour les billes HMM-V au centre du réseau, le coeffi-cient de diffusion l’est bien davantage. Le centrage de ces billes est ainsi moins précis qu’avec la HMM V. A notre surprise, nous avons observé que la précision du centrage ne dépend pas de l’espacement entre les deux lignes de nucléation, donc de la taille du sys-tème. Le comportement des billes est décrit par un modèle à trois états dans lequel la bille sonde localement la polarité nette du réseau en se détachant et en se rattachant fré-quemment aux filaments. Une séquence stochastique de déplacements dirigés dans un état attaché aux filaments et d’explorations diffusives dans un état détaché, conduit à une marche aléatoire biaisée avec un coefficient de diffusion et une vitesse effectifs. Notre description physique indique que la précision du positionnement des billes dépend du gra-dient de polarité nette du réseau de filaments ainsi que de la distance moyenne de par-cours des billes dans l’état attaché à l’actine. Nos résultats démontrent ainsi le rôle clef que joue l’architecture du réseau de filaments sur les propriétés du transport. Dans la cellule, les moteurs moléculaires permettent également la réorganisation des filaments du cytosquelette. En ajoutant nos moteurs moléculaires en solution, nous avons observé qu’un réseau de filaments d’actine parallèles, polymérisés in vitro à partir d’une ligne ou d’un disque de nucléation, peut former spontanément des faisceaux oscil-lants. Ces oscillations ressemblent aux battements du flagelle du spermatozoïde. En parti-culier, le système génère des ondes de déformation transverses se propageant de la base à l’apex du faisceau oscillant à une vitesse de 0,5 µm/s. Au cours du temps, les faisceaux d’actine s’épaississent, ce qui conduit à un ralentissement de l’oscillation avec une période qui croît de 25 s à 40 s. De plus, nous avons observé que des faisceaux d’actine voisins sont capables de se synchroniser, comme c’est le cas entre les deux flagelles de l’algue Chlamydomonas. Notre système acto-myosine minimal permet donc d’imiter le battement de flagelles, bien que la nature des moteurs moléculaires et des filaments en jeu soit com-plètement différente. Ainsi, ce système fournit un nouvel outil pour étudier les propriétés physiques génériques du battement flagellaire.

  • Titre traduit

    Myosin-based motility in actin filament networks of controlled architecture in vitro


  • Résumé

    Molecular motors navigate the cytoskeleton to position vesicles and organelles at specific locations in the cell. Cytoskeletal filaments assemble into parallel, antiparallel or disordered networks, providing a complex environment that constrains active transport properties. Using surface micro-patterns of nucleation-promoting factors to control the geometry of actin polymerization, we studied in vitro the interplay between the actin-network architec-ture and cargo transport by small myosin assemblies. With two parallel nucleation lines, we produced an antiparallel network of overlapping filaments. We found that 200nm beads coated with processive myosin V motors displayed directed movements towards the mid-line of the pattern, where the net polarity of the actin network was null, and accumulated there. The bead distribution was dictated by the spatial profiles of bead velocity and diffu-sion coefficient, indicating that a diffusion-drift process was at work. Interestingly, beads coated with skeletal heavy mero-myosin II motors showed a similar behavior. However, although velocity gradients were sharper with myosin II, the much larger bead diffusion observed with this non-processive motor resulted in less precise positioning. Strikingly, bead positioning did not depend on the spacing between the nucleation lines. Our observa-tions are well described by a three-state model of bead transport, in which active beads locally sense the net polarity of the filament network by frequently detaching from and re-attaching to the filaments. A stochastic sequence of processive runs and diffusive search-es results in a biased random walk with an effective drift velocity and diffusion coefficient. Positioning relies on spatial gradients of the net actin polarity, as well as on the run length of the cargo in the attached state. Altogether, our results on a minimal acto-myosin system demonstrate the key role played by the actin-network architecture on motor transport. Molecular motors can also deform and reorganize the cytoskeleton. Adding heavy mero-myosin II or V in bulk, we observed that parallel networks of actin filaments emerg-ing from a nucleation line or disk can self-assemble into bundles that beat periodically like the flagellum of the spermatozoid. In a preliminary analysis, we observed waves of defor-mation travelling from the base to the tip of the bundle at a speed of 0,5 µm/s. As time went by, the bundles grew thicker, resulting in an increase of the beating period (range: 25-40 s). In addition, neighboring actin ‘flagella’ were able to synchronize, as observed in vivo for instance with the the two flagella of the algae Chlamydomonas. Our minimal acto-myosin system thus mimicked key properties of microtubule-based flagellar beating, de-spite the different nature of the motors and cytoskeletal filaments involved. This system thus provides a new tool to study the generic physical properties of flagellar beating.


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