?tudes structurales et fonctionnelles des acteurs de la d?gradation de la coiffe des ARNm chez la levure Saccharomyces cerevisiae.

par Cl?ment Charenton

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Marc Graille.

Soutenue le 20-09-2016

à Paris Saclay , dans le cadre de ?cole doctorale Approches interdisciplinaires : fondements, applications et innovation (Palaiseau, Essonne) , en partenariat avec Laboratoire de biochimie (Palaiseau, Essonne) (laboratoire) , ?cole polytechnique (Palaiseau, Essonne) (?tablissement op?rateur d'inscription) et de Laboratoire de Biochimie (laboratoire) .

Le président du jury était Yves Mechulam.

Le jury était composé de Marc Graille, Alice Lebreton, Alain Jacquier.

Les rapporteurs étaient Christophe Romier, Domenico Libri.


  • Résumé

    La r?gulation fine des m?canismes d??limination des ARN messagers (ARNm) au sein des cellules contribue au contr?le de l?expression g?n?tique ainsi qu?? l?adaptation rapide des niveaux de transcrits en r?ponse ? divers ?v?nements cellulaires ou stimuli externes. Elle intervient ainsi dans diff?rents aspects de la physiologie cellulaire : diff?rentiation, prolif?ration, hom?ostasie, inflammation ou encore d?fense anti-parasitaire. Les ARNm eucaryotes matures sont prot?g?s d?une d?gradation incontr?l?e par une coiffe et une queue poly(A), ? chacune de leurs extr?mit?s. Le premier ?v?nement amor?ant la d?gradation des ARNm est le raccourcissement de la queue poly(A) par le complexe CCR4/Not par un processus appel? d?ad?nylation. Ensuite, la coiffe 5? est ?limin?e pendant l??tape de ? decapping ? qui est consid?r?e comme une ?tape cruciale, irr?versible et extr?mement contr?l?e, n?cessaire ? la d?gradation rapide du corps du messager par Xrn1. L??tape de ?decapping? est effectu?e via le recrutement d?un complexe prot?ique form? de l?enzyme Dcp2 et de son co-activateur essentiel Dcp1. Cependant, ce complexe n?est que peu actif et n?cessite de nombreux co-facteurs pour ?tre pleinement efficace. Ces facteurs comprennent l?anneau LSm1-7 qui reconna?t l?extr?mit? 3? des ARNm d?ad?nyl?s et interagit avec Pat1, une prot?ine plateforme qui recrute l?h?licase Dhh1 et les prot?ines activatrices du decapping Edc1-2-3. Tous ces facteurs sont organis?s au sein d?un r?seau d?interaction complexe et dynamique qui, dans certaines conditions, colocalise dans les P-bodies, des foyers cytoplasmiques impliqu?s dans la d?gradation des ARNm et dans la r?pression de la traduction.M?me si de nombreuses ?tudes ont r?v?l? l?importance des interactions prot?ine/prot?ine dans le processus de decapping, peu d?informations sont disponibles sur les m?canismes mol?culaires du recrutement et d?activation de Dcp2 par ses diff?rents co-facteurs. De m?me, en raison de l?absence de structure de Dcp2 en complexe avec un ARNm coiff?, les d?tails mol?culaires de la reconnaissance et du clivage de la coiffe sont inconnus. Mon projet de th?se a pour but de r?pondre ? ces questions par l??tude fonctionnelle et structurale des acteurs du decapping, en utilisant les prot?ines de la levure Saccharomyces cerevisiae comme syst?me mod?le, puisque la plupart des acteurs du decapping sont conserv?s au sein des eucaryotes. Dans ce but, j?ai exprim? par g?nie g?n?tique et isol? la majorit? des facteurs impliqu?s dans le ?decapping? et reconstitu? plusieurs sous complexes comprenant Dcp2 et ses diff?rents cofacteurs.

  • Titre traduit

    Structural and functionnal studies of the actors of mRNAs decapping in yeast Saccharomyces cerevisiae.


  • Résumé

    MRNA decay is a highly regulated process allowing cells to rapidly adapt their abundance of transcripts to environmental conditions. Eukaryotic mRNAs are protected from uncontrolled decay by a cap structure (m7GpppX) and a poly(A) tail at their 5? and 3? ends, respectively. The first event initiating the 5? to 3? degradation pathway is the shortening of the poly(A) tail by the CCR4/Not complex through a process known as deadenylation. Then the 5? cap is degraded during the decapping step, which is considered as a crucial and irreversible step before rapid degradation of RNAs. Decapping is accomplished by the recruitment of a protein complex formed by the Dcp2 catalytic subunit and its activator Dcp1. However, this complex has a low intrinsic decapping activity and requires several accessory factors to be fully efficient. These include the Lsm1-Lsm7 complex that binds to the 3? end of deadenylated mRNAs and promotes decapping. This complex binds to Pat1, a scaffolding protein recruiting other accessory proteins such as Dhh1 and Edc1-3 proteins (Enhancer of Decapping), which favor decapping. After efficient removal of the cap, Xrn1 (the major cytoplasmic 5?-3? exonuclease) is recruited and degrades the resulting uncapped RNAs. Interestingly, all these proteins are part of dynamic and multifunctional protein assemblies that, under conditions, localize into cytoplasmic foci known as P-bodies.Although many studies have revealed the importance of these protein/protein interactions, little is known concerning the mechanisms of recruitment and activation of the decapping enzyme by its numerous co-factors. Moreover, in the absence of Dcp2 in complex with a capped RNA, molecular details of cap recognition and cleavage are lacking. My thesis project aims at answering these open questions with the structural and functional studies of the decapping machinery, using yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism, as most of decapping actors are well conserved among eukaryotes. For this purpose, I expressed and purified the majority of the decapping factors and reconstituted several sub-complexes including Dcp2 and its cofactors.


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