Étude de la production de biomolécules par AFM-IR

par Rolando Rebois

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Alexandre Dazzi.

Le président du jury était Fathi Moussa.

Le jury était composé de Alexandre Dazzi, Fathi Moussa, Muriel Mercier, Sophie Lecomte, Olivier Gonçalves, Ariane Deniset-Besseau.

Les rapporteurs étaient Muriel Mercier, Sophie Lecomte.


  • Résumé

    Le sujet de thèse porte sur l’étude de l’accumulation de vésicules de TriAcylGlycérol (TAG) chez Streptomyces, une bactérie du sol filamenteuse utilisée dans l’industrie pour sa production d’antibiotiques. Le TAG est un précurseur direct du bio-diesel puisqu’il permet, suite à une transestérification, l’obtention de glycérol et de bio-diesel.L’objectif principal de la thèse est de regarder l’effet de la source de carbone présente dans le milieu nutritif sur la production de TAG par la bactérie lors d’études cinétiques afin de trouver des souches sur-productrices. Deux sources de carbone sont utilisés : Le glucose, source de carbone classique généralement utilisé en microbiologie, et le glycérol qui est un « déchet » de l’industrie. Afin de suivre le contenu lipidique, une première étude globale utilisant un spectrophotomètre infra-rouge (IR), nous a permis de suivre l’évolution de la production de TAG par la bactérie au sein de notre milieu de culture lors d’études cinétiques de 96h. Il a été montré, par exemple, que pour la souche sauvage S. lividans, la source de carbone introduite (glucose ou glycérol) n’a pas d’influence observable sur la production de TAG par la bactérie au cours de la cinétique. Cependant, la technique FTIR nous donne uniquement une information globale sur la production de TAG mais ne nous donne aucune indication sur l’évolution des vésicules à l’intérieur de la bactérie au cours du temps. C’est pourquoi une deuxième étude, plus locale, à l’aide d’un nanoIR, couplage entre un Microscope à Force Atomique (AFM) et un laser IR pulsé permet de localiser au sein de la bactérie les vésicules lipidiques. Cela permet d'observer la dynamique de production du TAG et d'obtenir des pistes sur le métabolisme de production par la bactérie.

  • Titre traduit

    Study of the biomolecules’ production by AFM-IR


  • Résumé

    Streptomyces is a genus of Gram+ filamentous soil bacteria well known for their ability to produce antibiotics and other molecules useful as therapeutic or phytosanitary agents in medicine or agriculture. Under specific growth conditions some strains can store an excess of carbon into TriAcylGlycerols (TAGs), a direct Bio-diesel precursor. Streptomyces is thus an interesting canditate to generate bio-oils by fermentation. In this study, our goal is to evaluate, at the subcellular scale, the size/shape and localization of storage lipid inclusions in different Streptomyces strains (such as Streptomyces lividans (TK24), Streptomyces coelicolor (M145)…).In a previous study, the global TAGs content of those strains was easily and precisely quantified using infrared (IR) spectroscopy and thin layer chromatography revealing among other things that S. coelicolor has a very low TAGs content whereas S. lividans has an high TAG content. This was possible since TAG molecules show a specific response in the mid-infrared (IR) region, quite distinct from that of the other cellular constituants.Triacylglycerols posses several absorption bands in IR. In particular we can easily distinguish the band of the C=O stretching of the esters at 1741 cm-1 from the amide I band (protein signature) of the bacterium.For the study of the local repartition of TAG inside the cells, a combination of atomic force microscopy and infrared spectroscopy was employed in order to create sub-cellular chemical maps that allow label-free identification of TAG inclusions in Streptomyces cytoplasm using their specific absorption properties at 1741 cm-1. AFM-IR is a user-friendly benchtop technique that enables infrared spectroscopy with a spatial resolution well below conventional optical diffraction limits. It acquires IR absorption imaging with lateral resolution down to 100 nm.This technique coupled with classical FTIR measurements constitutes a powerful tool to study TAG metabolism in Streptomyces and can be easily used to control the rate of lipid accumulation during the fermentation process. Hence, the AFM-IR technique is likely to provide new insights into the constitution of the fatty inclusions and the role of TAGs in the morphological and metabolic differentiation processes that characterize Streptomyces developmental cell cycle.


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