Organisation du réseau cortical de microtubules chez Arabidopsis thaliana : contribution des protéines EB1 et MAP65-1

par Arthur Molines

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Frédéric Coquelle.

Le président du jury était Marianne Delarue.

Le jury était composé de Frédéric Coquelle, Marianne Delarue, Olivier Hamant, Annie Andrieux, Franck Perez, Magalie Uyttewaal.

Les rapporteurs étaient Olivier Hamant, Annie Andrieux.


  • Résumé

    Les microtubules sont des filaments protéiques dynamiques, essentiels au bon fonctionnement de la plupart des cellules eucaryotes. L’organisation de ce réseau de fibres constitue un enjeu majeur pour la cellule, puisque c’est de cette organisation que découle une grande partie de ses fonctions. Dans les cellules animales, la protéine EB1 (End Binding-1) est impliquée dans la polarisation du réseau de microtubules. Arabidopsis thaliana possède trois gènes orthologues bien conservés, mais dont les fonctions sont encore mal connues, alors même que l’orientation et l’organisation du réseau de microtubule sont critiques pour le développement des plantes. En particulier, dans les cellules en élongation, le réseau cortical de microtubules est perpendiculaire à l’axe de croissance et permet, en participant à la synthèse de la paroi, de restreindre la croissance en épaisseur au profit d’un allongement. Les microtubules corticaux ne sont pas isolés les uns des autres, ils s’associent latéralement pour former des faisceaux, ajoutant ainsi un niveau de complexité, et donc de régulation, à l’architecture du réseau microtubulaire chez Arabidopsis thaliana. La formation et la maintenance du réseau de faisceaux parallèles de microtubules constituent l’objet principal de ce travail de thèse. Chez Arabidopsis thaliana, EB1 est impliquée, à l’échelle macroscopique, dans la croissance directionnelle des racines. Toutefois, les fonctions subcellulaires de la protéine étaient peu connues au début de nos investigations. Tout d’abord, notre étude a permis de montrer que le réseau cortical de microtubules est désorganisé chez des plantes mutantes dépourvues de protéine EB1 cytoplasmique. De plus, la combinaison de la microscopie super-résolue STED et d’une procédure d’analyse d’image que nous avons élaborée au laboratoire, a mis en évidence une diminution significative du nombre de microtubules par faisceau en absence de EB1. Nous avons également observé une hypersensibilité des racines mutantes à la dureté du milieu, confirmant des données publiées précédemment. Pris dans leur ensemble, ces résultats suggèrent : (1) l’importance de l’organisation du réseau cortical de microtubules dans la réponse de la racine au toucher ; (2) une probable interdépendance entre organisation du réseau et formation des faisceaux. Ensuite, afin de confirmer le probable lien fonctionnel entre la formation des faisceaux de microtubules et organisation globale du réseau microtubulaire cortical, nous avons étudié des plantes mutantes pour MAP65-1, une protéine déjà décrite pour sa capacité à former des faisceaux in vitro. Nos premiers résultats, tendent à confirmer cette fonction de MAP65-1 in vivo et révèle, pour la première fois, une implication significative de cette protéine dans l’arrangement parallèle des microtubules corticaux. Si ce résultat ne met pas en évidence la relation de cause à effet qui relie ces deux phénomènes, il confirme toutefois l’existence d’un lien entre les deux niveaux de régulation. Enfin, dans le but de mieux comprendre les mécanismes permettant aux protéines EB1 et MAP65-1 de former des faisceaux de microtubules, nous avons entamé une analyse de leurs propriétés intrinsèques in vitro, en système purifié. Les premiers résultats, très préliminaires, indique un effet stimulateur de EB1 sur la capacité de MAP65-1 à former des faisceaux de microtubules. Cette thèse a contribué à la compréhension des mécanismes qui régissent l’organisation du réseau de microtubules corticaux chez Arabidopsis thaliana, incluant la formation des faisceaux de microtubules et le rôle joué par EB1 et MAP65-1 dans ce contexte. Elle confirme également l’implication du réseau de microtubules dans le contrôle de la croissance racinaire et suggère fortement sa participation à la réponse aux contraintes mécaniques.

  • Titre traduit

    Cortical Microtubules Network Organization in Arabidopsis thaliana : Contribution of EB1 and MAP65-1 proteins


  • Résumé

    Microtubules are essential dynamic filaments of most eukaryotic cells. Microtubule network organization is tightly controlled within cells since most of microtubule functions come from their spatial arrangement. In animal cells, EB1 (End Binding-1 protein) is well known as a major regulator of microtubule network polarization. Though well conserved throughout evolution, Arabidopsis thaliana possesses three EB1 orthologous genes with unclear functions, while microtubule network orientation and organization are critical for plant development. During plant cell expansion, cortical microtubules are organized as parallel fibers that are perpendicular to the elongation axis. This particular organization is thought to promote cell elongation rather than thickening by controlling cell wall synthesis. Cortical microtubule are not isolated from each other, they are laterally associated within bundles, bringing an additional level of complexity, and therefore of regulation, to the microtubule network in plants. Microtubule bundles formation and maintenance are the main interest of this PhD-thesis work. In plants, EB1 proteins had already been involved in directional root growth, but their subcellular functions remained unclear. Our study revealed first that the cortical microtubule network is disorganized in plants lacking cytoplasmic-EB1 protein. Moreover, using super-resolution microscopy combined with an original image processing, we showed that the average number of microtubules per bundle is significantly reduced in the absence of EB1. In addition, EB1-defective roots display a hypersensitivity to medium hardness as mentioned elsewhere before. Altogether, our data suggest: (1) an involvement of the microtubule network in root response to touch; (2) a possible relationship between microtubule-network organization and bundle formation. Then, in order to confirm the functional link between bundle formation and network organization, we tackle the study of MAP65-1 mutant plants. MAP65-1 is a protein well described for its ability to make microtubule bundles in vitro. Our investigations confirmed this function for MAP65-1 in vivo and reveal its involvement in cortical microtubule network organization. Although this result does not reveal any causal connection between both phenomena, it highlights the link between the two levels of complexity that are bundle formation and spatial arrangement of microtubules. Finally, to get insight into the molecular mechanisms allowing EB1 and MAP65-1 to make microtubule bundles, we developed in vitro experiments using purified components. Preliminary results indicate that EB1 stimulates MAP65-1 ability to make bundles, but this remains to be further investigated. Hence, this thesis work contributed to decipher the mechanisms governing microtubule network organization in Arabidopsis thaliana. In particular, it revealed the involvement of EB1 proteins and MAP65-1 in this task. This work further confirmed the role of microtubules in root growth and strongly suggested their involvement in the response to mechanical sensing.


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