bases structurales de la motilité des kinésines

par Luyan Cao

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Marcel Knossow et de Benoît Gigant.

Le président du jury était Philippe Minard.

Le jury était composé de Marcel Knossow, Benoît Gigant, Philippe Minard, Carolyn Moores, Daniel Picot, Guy Lippens.

Les rapporteurs étaient Carolyn Moores, Daniel Picot.


  • Résumé

    Les kinésines sont des protéines moteur liées au cytosquelette de microtubules. Elles convertissent l’énergie provenant de l’hydrolyse de l’ATP en un travail mécanique. Leur fonction typique est de se déplacer le long du microtubule pour véhiculer des charges. La plupart des kinésines sont des dimères. Elles comprennent un domaine moteur, qui porte à la fois les sites de liaison du nucléotide et du microtubule, un domaine intermédiaire de dimérisation et une partie dite « queue » qui confère la spécificité des charges à transporter. Mon objectif est d’établir le mécanisme moléculaire à la base de la motilité, avec un intérêt particulier pour la détermination des variations structurales du domaine moteur de la kinésine le long de son cycle mécano-chimique. Au cours de ma thèse, mon objet d’étude principal a été la kinésine-1 humaine, encore appelée kinésine conventionnelle.J’ai étudié plus particulièrement deux aspects du cycle mécano-chimique de la kinésine-1, en combinant des approches de biologie structurale et l’étude de mutants. Les deux aspects concernent l’étude de la fixation de la kinésine-ADP au microtubule, conduisant à l’éjection du nucléotide et à une liaison forte de la kinésine au microtubule. Dans un premier temps, j’ai déterminé la structure du domaine moteur de la kinésine-1, dépourvue de nucléotide, et sous forme d’un complexe avec la tubuline. La tubuline est la protéine constitutive des microtubules. Cette structure était la donnée principale qui nous manquait dans le cycle structural de la kinésine. En comparant cette structure avec celle de la kinésine dans un état ATP, on peut rendre compte des changements de conformation de la kinésine selon le mouvement de trois sous-domaines du domaine moteur. Cette analyse explique notamment le lien entre la fixation de l’ATP et l’ouverture d’une poche hydrophobe distante de 28 Å du site du nucléotide. Cette cavité va accommoder le premier résidu du neck linker, conduisant à la stabilisation de ce peptide situé en partie C-terminale du domaine moteur. En s’ordonnant, le neck linker va faire avancer la charge ainsi que l’autre domaine moteur de la kinésine dimérique. Il lie ainsi la fixation de l’ATP au mouvement. L’étude de l’effet de mutations du neck linker montre aussi comment, réciproquement, le neck linker bloque la kinésine dans la conformation active pour l’hydrolyse de l’ATP. Ceci diminue la probabilité que l’ATP soit hydrolysé avant que l’étape mécanique se soit produite; cet aspect est essentiel pour rendre compte de la processivité de la kinésine-1.Ces données structurales suggèrent également comment la fixation de la kinésine-ADP au microtubule accélère l’éjection de l’ADP. Pour étudier cet aspect plus en détail, j’ai étudié l’effet de mutations sur la vitesse de largage de l’ADP. L’idée était de mimer à l’aide de mutations la fixation au microtubule. J’ai identifié ainsi deux séries de mutants qui présentent une vitesse accélérée de largage spontané de l’ADP, ce qui suggère deux voies pour interférer avec la fixation du nucléotide. J’ai ensuite déterminé la structure de deux de ces mutants dépourvus de nucléotide, ainsi que celle de la kinésine de départ également dans une forme apo, obtenue par digestion de l’ADP. En absence de microtubule, la kinésine dépourvue de nucléotide adopte une conformation soit à l’image de celle de la kinésine-ADP, ou proche de celle de la kinésine-apo liée à la tubuline. Dans un contexte naturel, seule la deuxième conformation est compatible avec la fixation au microtubule. L’ensemble de ces résultats suggère que le microtubule accélère l’éjection du nucléotide par un double mécanisme : en interférant avec la liaison du magnésium et en déstabilisant le motif P-loop de liaison du nucléotide.

  • Titre traduit

    structural basis of kinesin motility


  • Résumé

    Kinesins are a family of microtubule-interacting motor proteins that convert the chemical energy from ATP hydrolysis into mechanical work. Many kinesins are motile, walking along microtubules to fulfill different functions. Most kinesins are dimers, the monomer comprising a motor domain, a dimerizing stalk domain, and a tail domain. The motor domain contains both the nucleotide-binding site and the microtubule-binding site. I am interested in the molecular mechanism of kinesin's motility. In particular I want to establish the structural variations of the kinesin motor domain along with the mechanochemical cycle of this motor protein. During my thesis, I have focused my work on the human kinesin-1, also named conventional kinesin, which is the best characterized kinesin.I have studied two aspects of the kinesin mechanochemical cycle, by combining structural and mutational approaches. Both aspects rely on the binding of ADP-kinesin to a microtubule, which leads to the release of the nucleotide and to a tight kinesin-microtubule association. First I determined the crystal structure of nucleotide-free kinesin-1 motor domain in complex with a tubulin heterodimer, which is the building block of microtubule. This structure represented the main missing piece of the structural cycle of kinesin. Three subdomains in the kinesin motor domain can be identified through the comparison of my structure with ATP-analog kinesin-1-tubulin structure. The relative movements of these subdomains explain how ATP binding to apo-kinesin bound to microtubule triggers the opening of a hydrophobic cavity, 28 Å distant from the nucleotide-binding site. This cavity accommodates the first residue of the “neck linker”, a short peptide that is C-terminal to the motor domain, allowing the neck linker to dock on the motor domain. The docking of the neck linker is proposed to trigger the mechanical step, i.e. the displacement of the cargo and the stepping of the dimeric kinesin. By studying mutants of the neck linker, I have shown that, reciprocally, this peptide locks kinesin in the ATP state, which is also the conformation efficient for ATP hydrolysis. Doing so, it prevents the motor domain from switching back to the apo-state. It prevents also an untimely hydrolysis of ATP, before the mechanical step has occurred. These features are required for movement and processivity.Second, these structural data also suggest how the binding of ADP-kinesin to tubulin enhances nucleotide release from kinesin. To further study this step of the kinesin cycle, I studied the effect of kinesin-1 mutations. These mutations were designed in isolated kinesin to mimic the state when kinesin is bound to a microtubule. I identified two groups of mutations leading to a high spontaneous ADP dissociation rate, suggesting that there are two ways to interfere with ADP binding. Then I determined the crystal structures of the apo form of two mutants as well as that of the nucleotide-depleted wild type kinesin. It showed that apo-kinesin adopts either and ADP-like conformation or a tubulin-bound apo-like one. In the natural context, the second one is stabilized upon microtubule binding. Overall, the mutational and structural data suggest that microtubules accelerate ADP dissociation in kinesin by two main paths, by interfering with magnesium binding and by destabilizing the nucleotide-binding P-loop motif.


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