Caractérisation fonctionnelle des transporteurs lysosomaux orphelins

par Quentin Verdon

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Bruno Gasnier et de Corinne Sagné.

Le président du jury était Marc le Maire.

Le jury était composé de Bruno Gasnier, Corinne Sagné, Marc le Maire, Serge Birman, James Murray, Bruno Goud.

Les rapporteurs étaient Serge Birman, James Murray.


  • Résumé

    Les lysosomes contiennent environ soixante hydrolases différentes, qui peuvent dégrader une grande variété de macromolécules. L’activité de ces enzymes est dépendante du pH, maintenu dans les lysosomes entre 4.5 et 5.0 par une pompe à protons : la v-ATPase. Les produits de dégradation sont recyclés dans le cytoplasme par des transporteurs actifs secondaires de la membrane des lysosomes.Les maladies de surcharges lysosomales sont causées par des mutations de gènes codant pour des protéines lysosomales, souvent des enzymes. Elles sont caractérisées par un engorgement des lysosomes avec des agrégats ou des cristaux. Les symptômes associés à ces maladies sont variés, mais la moitié d’entre elles induisent des défauts neurologiques. L’étude de ces maladies a permis d’élucider la fonction de nombreuses enzymes, mais la connaissance des transporteurs lysosomaux reste parcellaire. Peu de ces transporteurs sont ainsi caractérisés au niveau moléculaire.Je me suis intéressé à deux gènes dont la mutation provoque une maladie de surcharge particulière : CLN3 et CLN7. Leur mutation provoque des céroïdes lipofuscinoses neuronales, des maladies de surcharge lysosomales caractérisées par une neurodégénérescence précoce et par l’accumulation dans les lysosomes d’un pigment autofluorescent, la lipofuscine. La mutation de 14 gènes différents cause une céroïde lipofuscinose neuronale. J’ai étudié CLN3 et CLN7 car ils codaient pour des protéines membranaires du lysosome, qui pourraient donc être des transporteurs.Sur CLN7, j’ai effectué des tests de transport en utilisant les acides aminés comme substrats potentiels, sans résultats probants. Concernant CLN3, le contenu métabolique de lysosomes a été étudié par spectrométrie de masse dans des souris WT ou de souris où le gène CLN3 était déficient. Les lysosomes des cellules déficientes contenaient moins de produits de la protéolyse, ce qui suggérait que CLN3 était important pour la protéolyse lysosomale. Cela a été confirmé par des mesures plus directes sur des neurones et des fibroblastes primaires, et sur des fibroblastes immortalisés. Ces résultats pourraient aider à comprendre les premières étapes de la physiopathologie dans les cellules où des gènes CLN sont déficients.Pour accroître le nombre de transporteurs lysosomaux potentiels, j’ai participé à la finalisation d’une étude par protéomique de la membrane lysosomale. Elle a révélé 46 potentiels transporteurs de fonction encore inconnue. Dans cette liste, j’ai étudié TMEM104, SPINSTER, MFSD1, SLC37A2, TTYH3 et SNAT7. Pour ce faire, j’ai d’abord muté les motifs d’adressage de ces protéines pour les rediriger, lors de leur synthèse, vers la membrane plasmique, afin de faciliter leur étude. Aucune fonction claire n’a pu être identifiée par cette approche.SNAT7 appartenait cependant à une famille de transporteurs de glutamine, ce qui était suffisamment encourageant pour envisager d’autres approches. Sa fonction a ainsi été étudiée en développement un nouveau test indirect basé sur la détection d’une surcharge artificielle des lysosomes en acides aminés. Un test fonctionnel plus direct a ensuite été mis au point sur des fractions enrichies en lysosomes en utilisant des acides aminés radiomarqués. Ces deux tests ont montré que SNAT7 était un transporteur spécifique de l’asparagine et de la glutamine.J’ai enfin étudié l’hypothèse suggérant que SNAT7 pourrait jouer dans la nutrition de cellules cancéreuses. En effet, certaines utilisent la glutamine comme nutriment principal à la place du glucose ; mais les apports sanguins en glutamine, dans les tumeurs, sont parfois insuffisants. La glutamine est donc obtenue par macropinocytose de protéines extracellulaires et dégradation lysosomale de ces protéines, avant un recyclage vers le cytoplasme. J’ai montré qu’en l’absence de SNAT7, ce phénomène était bloqué. SNAT7 est donc une cible thérapeutique intéressante pour tenter de bloquer l’approvisionnement des cellules cancéreuses en glutamine.

  • Titre traduit

    Towards the Elucidation of Orphan Lysosomal Transporters


  • Résumé

    Within lysosomes, about sixty different hydrolases degrade macromolecules. This degradation is dependent on the acidity of the lysosomal lumen, which pH ranges between 4.5 and 5.0. The lysosomal pH is maintained by the v-ATPase, a proton pump. Lysosomal degradation generates catabolites, which can be recycled to cytosol by secondary active transporters: lysosomal transporters.The dysfunction of lysosomal proteins leads to lysosomal storage disorders (LSDs), rare inherited metabolic diseases characterised by accumulation of material inside lysosomes. Depending on the mutated gene, symptoms of LSDs vary greatly, although about half of LSD patients display some kind of neurodegenerative symptoms. Studying the physiopathology of LSDs has led to a good understanding of the function of lysosomal enzymes, but the knowledge of lysosomal transporters remain poor, since only a few LSDs has been shown to be linked with a mutation in a lysosomal transporter gene.I focused on two proteins which dysfunction causes a special type of LSDs: CLN3 and CLN7. Mutations in CLN3 and CLN7 cause neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs), a special type of LSD which has mostly neurodegenerative symptoms and which is characterized by the accumulation of a specific pigment inside lysosomes: lipofuscin. There are fourteen NCL genes, but CLN3 and CLN7 are the two only proteins of the family which are resident proteins of the lysosomal membrane, suggesting they might be transporters.Amino acids were screened as possible substrates for CLN7, but none could be shown to be transported. For CLN3, the content in metabolites of lysosomes from Cln3-deficient mice and from WT mice were compared by mass spectrometry, revealing a specific decrease in the amount of catabolites of proteins in lysosomes from Cln3-deficient mice. This suggested a lack of lysosomal proteolysis, which was checked in neurons, in primary fibroblasts and in immortalized fibroblasts. These results suggested that CLN proteins could take part to a metabolic pathway important for lysosomal proteolysis and, more generally, for neuronal health. These results could help improve the understanding of the early steps of NCL physiopathology.To extend the number of candidates for lysosomal transporters, I took part to the validation step of an extensive proteomic study of the lysosomal membrane, which revealed forty-six new candidates for lysosomal transporters. I studied in more details TMEM104, SPINSTER, MFSD1, SLC37A2, TTYH3 and SNAT7. Proteins were overexpressed in HeLa cells to check for lysosomal localization. Then, their putative sorting motifs were mutated to misroute their expression to plasma membrane and to enable their functional study. No function could elucidate for the first five candidates.SNAT7 could not be misrouted to plasma membrane either, but, since it belonged to a family of transporters for glutamine, its function was studied by an indirect assay based on a lysosomal overload in amino acids and a direct transport measure on lysosome-enriched cellular fractions. Thus, SNAT7 was shown to be a lysosomal transporter selective for glutamine and asparagine.The function of SNAT7 is the nutrition of cancer cells was then studied. Many cancer cells use glutamine as their main source of carbon, nitrogen and energy. Because of insufficient blood supply, they use macropinocytosis to uptake extracellular proteins, which degradation in lysosomes generates glutamine. Then, glutamine is recycled to the cytosol. SNAT7 was shown to be critical in this process: in glutamine-dependent cancer cells, when SNAT7 expression is reduced, cells cannot obtain glutamine from extracellular proteins. Thus, blocking SNAT7 is a promising approach to target specifically the metabolism of cancer cells.


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