Modulating the activity of NADPH oxidase by oxidative stress participants ; lipids and nanoparticles A cell-free system study

par Rawand Masoud

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Tania Bizouarn et de Chantal Houée Levin.

Le président du jury était Sandrine Lacombe.

Le jury était composé de Tania Bizouarn, Chantal Houée Levin, Sandrine Lacombe, Franck Fieschi, Pham My-chan Dang, Mariano Ostuni.

Les rapporteurs étaient Franck Fieschi, Pham My-chan Dang.

  • Titre traduit

    Modulation de l’activité de la NADPH oxydase par des participants au stress oxidatif, les nanoparticules et le cholesterol


  • Résumé

    La NADPH oxydase de phagocyte est un complexe enzymatique impliqué dans la défense immunitaire contre les pathogènes. Elle est constituée du flavocytochrome b558 membranaire (Cyt b558), composé de deux sous-unités (gp91phox et p22phox) et de quatre sous-unités cytosolubles, p47phox, p67phox, p40phox, et Rac. Sa fonction est de produire au niveau de la paroi des pathogènes des ions superoxyde (O2•−) qui sont transformés en d'autres espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui attaquent les lipides, les protéines et l’ADN environnants. Après activation du phagocyte, les sous-unités cytosoliques subissent des modifications post-traductionnelles et migrent vers la membrane pour constituer le complexe NADPH oxydase activé. Le rôle délétère des ROS dans les maladies est connu depuis longtemps. Le but de ma thèse a été d’étudier l’influence de molécules exogènes qui induisent une augmentation du stress oxydatif, sur l’activité de la NADPH oxydase.Dans ce travail, nous avons étudié le fonctionnement de la NADPH oxydase dans un système in vitro dans lequel l’enzyme était activée par la présence d'acide arachidonique (AA). J’ai étudié l'influence de deux types de molécules: une classe de lipides et des nanoparticules (NPs). Pour simplifier le système, nous avons remplacé l’ensemble des sous-unités cytosoliques par une protéine unique appelé trimère qui correspond à une fusion des trois protéines cytosoliques p47phox, p67phox et Rac. Nous avons montré que le trimère est fonctionnellement comparable aux sous-unités cytosoliques séparées. La vitesse de production de O2•−, sa dépendances en fonction de la concentration en AA et de la température, et sa sensibilité aux radicaux libres étaient comparables lorsque le trimère ou les sous-unités séparées étaient utilisés.J’ai étudié les conséquences de la présence de cholestérol et de ses formes oxydées sur la production de O2•− par la NADPH oxydase. Nos résultats montrent clairement que le cholestérol et l’oxystérols ne sont pas des activateurs efficaces de la NADPH oxydase. L’addition d’une quantité physiologique de cholestérol déclenche une faible production d’ions superoxyde. L’addition de cholestérol à des concentrations du même ordre de grandeur pendant le processus d'assemblage (en présence de AA), a un rôle inhibiteur sur la production d’O2•−. Le cholestérol ajouté agit sur les composantes, cytosoliques et membranaires, conduisant à un assemblage imparfait. En conclusion, le cholestérol déjà présent dans la membrane des neutrophiles est optimale pour le fonctionnement de la NADPH oxydase.Il était intéressant de vérifier l'influence des nanoparticules de dioxyde de titane (TiO2) et de platine (Pt) sur le comportement de la NADPH oxydase sachant que l'internalisation cellulaire de ces NPs a pour effet d’activer les neutrophiles et les macrophages et contribue à une sur-production de ROS. En l’absence d'activateur mais en présence de NPs de TiO2 ou Pt, aucune production de O2•− n’était détectée indiquant que les NPs de TiO2 et Pt sont incapables d'activer le complexe par eux-mêmes aussi bien dans le système acellulaire que dans les neutrophiles. Cependant, une fois la NADPH oxydase activée (par AA), la vitesse de production des O2•− est augmentée jusqu’à 40% de sa valeur en l’absence de NPs de TiO2, cet effet étant fonction de leur concentration. Par contre, les NPs de Pt n’ont aucun effet sur l’activité de la NADPH oxydase aussi bien in vitro que dans les neutrophiles. En conclusion, l'hyperactivation de la NADPH oxydase et l'augmentation subséquente de la production de ROS induites par les NPs de TiO2 pourraient participer au développement du stress oxydatif tandis que l'absence d'effet Pt-NPs suggère qu'ils ne provoquent pas de sur-inflammation.


  • Résumé

    NADPH oxidase from phagocytes is a multi-subunit enzyme complex involved in the innate defense of organisms against pathogens. It is composed of the membrane-bound flavocytochrome b558 (Cyt b558), comprising two subunits (gp91phox, and p22phox) and four cytosolic components, p47phox, p67phox, p40phox, and Rac. Its function is to produce in the vicinity of the pathogen, superoxide ions that are transformed subsequently into other reactive oxygen species (ROS) and will damage lipids, proteins and DNA. Upon phagocyte activation, the cytosolic subunits undergo posttranslational modifications and migrate to the membrane bound Cyt b558 to constitute the activated NADPH oxidase complex. The damaging role of ROS in cardiovascular diseases has been known for some decades. The aim of my thesis was to study the influence on NADPH oxidase activity, of molecules coming from food and industrial products and known to be involved in increase of oxidative stress.In this work, we studied the NADPH oxidase functioning in an in vitro system in which the components of the enzyme are mixed and activated by the introduction of an amphiphile the arachidonic acid (AA). During my PhD, I have studied the influence of two types of oxidative stress participants: lipids and nanoparticles (NPs). For simplicity, we have replaced the cytosolic subunits by a single protein called trimera, which is a fused construction of three cytosolic proteins p47phox, p67phox and Rac. We have shown that trimera is functionally comparable with the separated cytosolic subunits. The rates of production of O2•−, the dependences of the activity in function of AA concentration and temperature, the presence of two states in the activation process and the sensitivity of NADPH oxidase to free radicals were comparable when either trimera or separated subunits were used.I investigated the consequences of the addition of cholesterol on NADPH oxidase, on the production of ROS. Our results clearly show that cholesterol and oxysterols are not efficient activators of NADPH oxidase. Concentrations of cholesterol similar to what found in neutrophiles trigger a low superoxide production. Addition of cholesterol during the assembly process (in presence of AA) at similar or higher concentrations, has an inhibitory effect on the production of O2•−. Added cholesterol acts on both cytosolic and membrane components, leading to imperfect assembly and decreasing the affinity of cytosolic subunits to the membrane ones. In conclusion, we showed that the cholesterol already present in the phagocyte membrane is optimal for the function NADPH oxidase.It was of interest to check the influence of titanium dioxide (TiO2) and platinum (Pt) NPs on NADPH oxidase especially that cellular internalization of NPs was shown to activate neutrophils and contribute to O2•− overproduction via NADPH oxidase. In the absence of activators and presence of TiO2 or Pt NPs, no production of O2•− could be detected in in vitro system as well as in neutrophils indicating that TiO2 and Pt NPs were unable to activate by themselves the complex. However once the NADPH oxidase was activated by AA, TiO2 NPs increased the rate of O2•− production by up to 40%, this effect being dependent on their concentration. Differently, Pt NPs had no effect both on in vitro system as well as on neutrophils. In conclusion, the hyper-activation of NADPH oxidase and the subsequent increase in ROS production by TiO2 NPs could participate to oxidative stress development while the absence of Pt-NPs effect suggest that they do not induce inflammation status via this complex.


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