Long non-coding RNA-based mechanisms for the inhibition of cell growth and development by 5 - Fluorouracil

par Bingning Xie

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Michael Primig.

Soutenue le 03-11-2016

à Rennes 1 , dans le cadre de École doctorale Vie-Agro-Santé (Rennes) , en partenariat avec Université Bretagne Loire (ComuE) et de Institut de recherche en santé environnement et travail -- Rennes (laboratoire) .

  • Titre traduit

    Mécanismes à base de ARNlnc pour l'inhibition de la croissance cellulaire et le développement par 5 – fluorouracil


  • Résumé

    Les ARNm codent pour les protéines, tandis qu'un grand nombre d'ARNs nommés longues ARNs non codants (ARNlnc) ne sont pas traduites en protéines. Les deux types d’ARNs existent en isoforms qui se distinguent à cause de l’épissage alternatif. Certains des ARNlnc jouent des rôles importants dans la croissance et différentiation cellulaire. Cependant, leurs fonctions dans la cytotoxicité de la chimiothérapie anti-cancéreuse médicamenteuse utilisant le 5-fluorouracile (5-FU) sont encore inconnues. Pendant mes travaux j'ai trouvé que le traitement par le 5-FU cause l’accumulation des ARNlnc. Ce phénomène est parfois, sous forme d’ARN double brin (ARNds) formé par une paire de transcrits chevauchant, corrélé négativement avec le niveau de la protéine codée par l'ARNm. Cette inhibition potentielle de la traduction des régulateurs du cycle cellulaire clés et les gènes essentiels en formant des l'ARNds peut éventuellement empêcher la progression du cycle cellulaire. Nos analyses prometteuses devraient inspirer des études approfondies des ARNlnc dans la cytotoxicité du 5-FU chez la levure et l’homme afin d’'améliorer la chimiothérapie. J'ai trouvé que la surexpression de RRP6, peut conduire à une résistance accrue au traitement par le 5-FU. Je démontre ensuite que l’ARNlnc MUT1312 forme des ARNds avec RRP6 qui sont négativement corrélés avec le niveau de la protéine Rrp6. Par ailleurs, la surexpression de MUT1312 pendant la mitose et associé avec une diminution d’Rrp6. Ainsi, mon étude suggère que MUT1312 soit impliqué dans la régulation de Rrp6 pendant la differentiation cellulaire. Mes recherches de MUT477/SWI4 indiquent la function importante de la méiose induite à long ARN non codantes en tant que forme d'ARN double brin potentiellement réguler la traduction. J'ai trouvé que SUT200 pourrait inhiber la transcription de CDC6 durant la méiose par read-through. Un cas comparable est MUT1465 et CLN2. J’ai fait un criblage in silico pour trouver des facteurs de transcription qui activent des MUTs durant la méiose. J’ai trouvé que la plupart des MUTs sont induites par Ndt80. MUT1465 est parmi eux : il pourrait être induite par Ndt80 ce qui inhiberait l’expression de CLN2 après l’initiation de la méiose. J’ai trouvé que la répression de certains MUTs par le complexe Ume6/Rpd3 en mitose est différemment régulée entre JHY222 et SK1. MUT100 qui ne possède pas l'élément USR1 fixé par Ume6, et qui est donc une cible indirecte, est déréprimé dans JHY22 ume6 mais pas dans SK1 ume6. Pour la régulation de l'étude de isoforme méiose, Nous avons trouvé que le complexe histone déacétylase Rpd3/Sin3/Ume6, empêche également l'induction de l'isoforme longue de BOI1 dans la mitose par liaison directe de liaison Ume6 à sa cible de URS1. Orc1 est importante pour la réplication de l'ADN. J’ai démontré que mORC1 est une cible directe de l'activateur Ndt80 et que son motif de fixation (MSE) est nécessaire pour l'induction de l’isoforme mORC1 et du gene méiotique SMA2 transcrit de façon divergente. J’ai trouvé qu'une souche incapable d’induire mORC1, contient des niveaux anormalement élevés d’Orc1 pendant la gamétogenèse, ce qui corréle mORC1 avec la baisse de la protéine Orc1. En conclusion, mes études au cours du doctorat révèlent des nouvelles cibles et ainsi offrent des nouvelles perspectives de l’amélioration de la chimiothérapie par le 5-FU. Les mécanismes incluent la formation d'un ARN double brin avec son ARNm anti-sens pour potentiellement inhiber la traduction de l'ARNm, et inhibition en aval de l'ARNm par transcription read-through d’une ARNlnc. Mon travail a également révélé un mécanisme de régulation des ARNlnc et les isoforms d’ARN pendent la croissance et la différentiation cellulaire.


  • Résumé

    RNAs are molecules with important functions in diverse cellular processes. mRNAs encode proteins, while a large number of RNAs called long noncoding RNAs (lncRNAs) are not translated into proteins. Both types of RNAs exist in various isoforms due to alternative splicing.Some of lncRNA play important roles in cell growth and differentiation. However, their functions in the cytotoxicity of the drug anticancer chemotherapy using 5-fluorouracil (5-FU) are still unknown. During my research I found that treatment with 5-FU causes accumulation of lncRNA. Acuumulated antisense lncRNA form double stranded RNA with the mRNAs , negatively correlated with the level of the protein encoded by the mRNA. This potential inhibition of translation of key cell cycle regulators and essential genes by forming dsRNA may possibly prevent the progression of the cell cycle. My results suggest that lncRNA are likely to play an important role in the cytotoxicity of 5-FU. Our promising testing should inspire in-depth studies of lncRNA in the cytotoxicity of 5-FU in yeast and humans to improve chemotherapy.Rrp6 is a 3'-5 'exoribonuclease, which plays an important role in the regulation and modification of rRNA, mRNA and lncRNA. I found that overexpression of RRP6, the homologue of the yeast EXOSC10 gene in mammals, can lead to increased resistance to treatment with 5-FU. I found that the lncRNA MUT1312 form dsRNA with RRP6 that are negatively correlated with the level of Rrp6 protein. Furthermore, overexpression of MUT1312 during mitosis and associated with a decrease of Rrp6. Thus, my study suggests that MUT1312 may involved in the regulation of Rrp6 during cell differentiation. I further explored the function of the double-stranded RNA in meiosis. My research about SWI4/MUT477 indicates the important function of meiosis induced long noncoding RNA as a form of double-stranded RNA potentially regulate translation. Another aspect of the function of lncRNA is to regulate the transcription of downstream mRNA. I found SUT200 could inhibit transcription of CDC6 during meiosis by read-through. A similar case is CLN2/MUT1465. I did an in silico screening to find transcription factors that activate MUTs during meiosis. I found that most MUTs are induced by Ndt80. MUT1465 is among them: it could be induced by Ndt80 which inhibit the expression of CLN2 after initiation of meiosis. I found that repression of certain MUTs by the Ume6 / Rpd3 complex in mitosis is regulated differently between JHY222 and SK1. MUT100 which does not have the Ume6 binding site URS1 element, and is therefore an indirect target is derepressed in JHY22 ume6 but not in SK1 ume6. For the study about regulation of meiosis isoform, we have found that the histone deacetylase complex Rpd3 / Sin3 / Ume6 prevents the induction of long isoform BOI1 in mitosis by direct binding Ume6 binding to its target URS1.Orc1 is important for DNA replication. I have demonstrated that mORC1 is a direct target of the Ndt80 activator and its binding motif (MSE) is required for induction of isoform mORC1 and meiotic gene SMA2 divergently transcribed. I found that a strain incapable of inducing mORC1 contains abnormally high levels of Orc1 during gametogenesis, which correlates with mORC1 declining Orc1 protein. Since eukaryotic genes often encode multiple transcripts with 5'-UTR of variable length, the findings are likely relevant to gene expression during development and disease in higher eukaryotes. In conclusion, my studies during PhD reveal new targets and thus offer new prospects for improving chemotherapy with 5-FU. Mechanisms include (1) the formation of a double strand with its antisense mRNAs to potentially inhibit translation of mRNA, and (2) downstream inhibition of mRNA transcription read-through of a lncRNA. My work also revealed a lncRNA regulatory mechanism and RNA isoforms dangling growth and cell differentiation.


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