Thérapie cellulaire dans un modèle préclinique de Dystrophie Musculaire de Duchenne : Développement par édition génomique de cellules thérapeutiques et traçables in vivo par imagerie médicale

par David Mauduit

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Stéphane Blot et de Isabel Punzon.

Le président du jury était Jean-Thomas Vilquin.

Le jury était composé de Laurent Coen.

Les rapporteurs étaient Gillian Butler-Browne, Didier Montarras.


  • Résumé

    La dystrophie musculaire de Duchenne de Boulogne (DMD) est une myopathie héréditaire liée au chromosome X et causée par une mutation du gène de la dystrophine. Affectant un garçon sur 5000, cette maladie entraine une dégénérescence progressive des muscles striés squelettiques et cardiaques. A ce jour, la DMD demeure une maladie invalidante, incurable et les personnes atteintes ont une espérance de vie de 30 ans. Parmi les thérapies innovantes en cours de développement, la thérapie cellulaire est une stratégie prometteuse. Cependant elle présente plusieurs limitations notamment liées à l’efficacité des types cellulaires utilisés et le devenir des cellules après injection in vivo. Le premier objectif de cette thèse est le développement d’une méthode d’imagerie pour étudier à l’échelle de l’organisme et de façon non invasive la biodistribution et la survie des cellules suite à leur injection systémique dans un modèle préclinique pertinent, le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), un modèle animal reproduisant fidèlement le phénotype DMD. Notre attention s’est portée sur l’utilisation du symporteur sodium iode (NIS) pour le suivi non invasif des cellules. Nous avons obtenu des cellules myogéniques exprimant le NIS, autorisant leur visualisation par scintigraphie grâce à la propriété d’absorption du technétium 99m conférée par ce symporteur. Nous avons montré in vitro que le NIS est fonctionnel pour la capture de radioactivité même après une différentiation avancée des cellules. En parallèle, nous nous sommes intéressés au type cellulaire. Les cellules primaires ayant une capacité de renouvellement limitée, cela restreint leur utilisation en thérapie et leur modification génomique. Afin de contourner cette limitation, plusieurs protocoles visant à obtenir des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) dérivées de cellules canines ont été utilisés. De plus, pour ne plus être dépendant de l’immunosuppression imposée par les greffes allogéniques, nous avons utilisé le système d’édition génomique CRISPR/Cas9 pour mettre au point une correction des cellules GRMD afin de permettre la réalisation de greffes autologues. Nous avons également utilisé le système CRISPR/Cas9 pour réaliser l’insertion ciblée du gène NIS dans un site précis du génome des cellules. Les résultats obtenus autorisent le développement de programmes comparant le potentiel thérapeutique de cellules dans un modèle préclinique de la DMD.

  • Titre traduit

    Cell therapy in a preclinical model of Duchenne Muscular Dystrophy : Development by gene editing of therapeutics cells, allowing their tracking in vivo


  • Résumé

    Duchenne muscular dystrophy (DMD), an X-linked recessive myopathy, is caused by mutations in the dystrophin gene. One boy out of 5000 is affected by this disease, which induces a progressive loss of skeletal striated and cardiac muscles. To date, DMD remains an invalidating disease and there is no cure for it. People suffering from DMD usually die in their 30’s. Among the innovative therapies currently under development, cell therapy is a promising strategy. However, it has some limitations related notably to a low efficiency of tested therapeutic cells and their tracking in vivo after injection. The first aim of this thesis is to develop an imaging method allowing non-invasive monitoring of biodistribution and survival of cells at the scale of a large organism, following systemic injection in the GRMD dog (Golden retriever muscular Dystrophy, a relevant animal model of DMD, as it replicates finely the DMD phenotype). We took interest in the sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter. We induced the expression of the NIS in myogenic cells to allow visualization of the cells by scintigraphy thanks to its ability to uptake technetium 99m. We showed that NIS is functional in the cells and they maintain their ability to differentiate. Primary cells have a limited self-renewal capability restraining their use in human cell therapy and gene editing. To overcome this limitation, we used several protocols to derive induced pluripotent stem cells (iPSCs) from adult canine cells. Furthermore, to avoid immune suppression protocols, we used the CRISPR/Cas9 gene editing tools to design a correction strategy of the GRMD mutation for future autologous injections. We also used CRISPR/Cas9 to perform a targeted integration of the NIS gene in a safe harbor locus. Results allow us to develop protocols to compare the therapeutic potential of candidate cells in a preclinical model of DMD.

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