More transparency in bioanalysis of exocytosis : application of fluorescent false neurotransmitters in coupling methodology of electrochemistry with fluorescence microscopy at ITO microelectrodes

par Xiaoqing Liu

Thèse de doctorat en Physico-Chimie Analytique

Sous la direction de Christian Amatore.

Soutenue le 26-09-2016

à Paris 6 , dans le cadre de École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris) , en partenariat avec Processus d'Activation Sélective par Transfert d'Energie Uni-électronique ou Radiatif (laboratoire) .

Le jury était composé de Didier Devilliers, Pedro De Oliveira, Manon Guille-Collignon, Frédéric Lemaître.

Les rapporteurs étaient Petra Hellwig, Fabien Miomandre.

  • Titre traduit

    Bioanalyse microélectrochimique de l'exocytose vésiculaire : utilisation de faux neurotransmetteurs fluorescents dans la méthodologie de couplage de l'électrochimie avec la microscopie de fluorescence sur microélectrodes d'ITO


  • Résumé

    L’exocytose vésiculaire est une voie physiologique majeure de la communication intercellulaire. Dans ce contexte, le TIRFM (microscopie de fluorescence par réflexion totale interne) et l’ampérométrie sont aujourd'hui les deux méthodes analytiques les plus fréquemment utilisées dans l’étude de l’exocytose. En raison de la complémentarité de ces deux techniques d’analyse pour le suivi de la sécrétion exocytotique, leur combinaison pour suivre la sécrétion exocytotique a d'abord été réalisée par notre groupe en 2011. Ce couplage a permis un enregistrement simultané des signaux fluorescents et ampérométriques avec une bonne résolution spatiale et temporelle. L'inconvénient majeur de ce travail reste le chargement indépendant des sondes optique et électrochimique dans les vésicules de sécrétion, ce qui entraîne la détection d’évènements « orphelins » ampérométriques ou optiques ainsi que la faible efficacité de détection des évènements couplés. Par conséquent, dans cette thèse, nous avons tenté de mettre à profit une sonde unique à la fois fluorescente et électroactive pour suivre l’exocytose par la méthodologie couplée TIRFM/ampérométrie. Ainsi, un analogue de neurotransmetteurs monoamine primaire, la 4-(2-amino-éthyl)-6-chloro-7-hydroxy-2H-1-benzopyran-2-one (nommé 1 dans ce travail), a été synthétisé.1 présente une fluorescence forte, stable et pH-dépendante. Lorsque cette entité est excitée à 405 nm, son intensité de fluorescence est presque doublée de pH 5 (valeur intra-vésiculaire) à 7 (valeur milieu extracellulaire). De plus, des études en voltammétrie ont pu mettre en évidence que 1 est oxydable sur électrode de carbone vitreux, microélectrode à fibre de carbone et ITO (oxyde d’indium dopé à l’étain), montrant ainsi une bonne électroactivité. La pénétration cellulaire dans les vésicules de cellules BON N13 a également été démontrée, prouvant la spécificité de l’interaction entre 1 et ces vésicules équipées d’un transporteur de monoamines primaires (VMAT). L’utilisation de 1 comme sonde unique optique et électrochimique pour le suivi de l'exocytose a ensuite été validée séparément dans des cellules BON N13 par TIRFM et ampérométrie. L’enregistrement simultané par fluorescence et électrochimie en utilisant 1 comme sonde double a ensuite été réalisé dans un microdispositif constitué d’électrodes ITO conductrice et transparente. Nos résultats basés sur la sonde unique 1 montrent qu’elle semble plus adaptée que toutes les stratégies antérieures impliquant deux sondes indépendantes. Les résolutions spatiale et temporelle de cette méthode combinée ont permis d'analyser des sécrétions d’exocytose de cellules marquées par 1. Une analyse ultérieure de ces signaux couplés optique et électrochimique sera à même d’étudier la corrélation entre le comportement du pore de fusion (dynamique d'ouverture/de fermeture, stabilité..) détecté par ampérométrie et le mouvement d'une vésicule en trois dimensions (ancrage, amarrage, fusion puis retrait dans le cytoplasme) détecté par TIRFM.


  • Résumé

    Vesicular exocytosis is a ubiquitous way for intercellular communications. TIRFM (total internal reflection fluorescence microscopy) and amperometry are nowadays the two most frequently used analytical methods with complementary features for its investigation. The combination of these two analytical techniques to track exocytotic secretions was firstly achieved by our group in 2011 and this new technique was demonstrated to show both high temporal and spatial resolutions by simultaneously recording the fluorescent and amperometric signals. The major disadvantage of this former work was the independent loading of optical and electrochemical probes to the secretory vesicles, which resulted in 'sightless' amperometric or optical signals as well as low coupling efficiency. Therefore, in this thesis, we attempted to develop a unique probe with dual fluorescent/electrochemical characteristics to track exocytotic process by TIRFM/amperometry coupling technique. This is why an analog of biogenic monoamine neurotransmitters, 4-(2-aminoethyl)-6-chloro-7-hydroxy-2H-1-benzopyran-2-one hydrochloride (named as 1 in this work) was synthesized. 1 exhibited bright, stable, pH-dependent fluorescence. When excited at 405 nm, its fluorescence intensity was almost doubled with the increase of pH values from 5 (similar to that in the vesicular lumen) to 7 (similar to the extracellular medium). Furthermore, in voltammetry, 1 was demonstrated to be easily electrooxidized on GCE (glassy carbon electrode), CFE (carbon fiber electrode) and ITO (indium tin oxide) electrodes surfaces, showing good electroactivity. 1 was also shown to penetrate easily into the vesicles of BON N13 cells within 1 hour incubation, testifying its specific affinity with these VMAT-equipped (vesicular monoamine transporter) vesicles. The applications of 1 as optical and electrochemical probes for exocytosis monitoring were then separately validated in BON N13 cells by TIRFM and amperometry measurements, respectively. Simultaneous recording of fluorescent and amperometric information by using 1 dual probes loaded cells was subsequently acquired in a microfabricated device constituted by conductive and transparent ITO electrodes. Our results based on the unique probe 1 for electrochemical and fluorescent detection of exocytotic release seemed more adapted than all the previous works involving independent probes. The high spatial and temporal resolutions of this combined method also allowed analyzing consecutive exocytotic secretions as well as overlapped events in 1-stained cells. Further analysis of these two signals with complementary information will shed more light on the correlation of the fusion pore behavior (opening/closure dynamics, stability…) measured by amperometry and the motion of a secretory vesicle in three dimensions (tethering, docking, fusion and retrieval) detected by TIRFM.



Le texte intégral de cette thèse sera accessible librement à partir du 27-09-2018

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