Synthèse biomimétique et automatisée de peptides crypto-thioester pour la ligation chimique native : application à des peptides naturels riches en cystéine

par Victor Terrier

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Agnès Delmas.

Le président du jury était Sylvain Routier.

Le jury était composé de Agnès Delmas, Sylvain Routier, Oleg Melnyk, Didier Boturyn, Vincent Aucagne, Denis Servent, Gilles Subra.

Les rapporteurs étaient Oleg Melnyk, Didier Boturyn.


  • Résumé

    Les peptides Cα-thioester jouent un rôle central dans la synthèse de protéines par voie chimique : ils sont des partenaires clés dans la ligation chimique native (NCL), réaction qui a révolutionné ce domaine. L’accès à ces peptides par Fmoc-SPPS, méthode largement utilisée dans les laboratoires, est encore restreint à des experts. Cette limitation représente à l’heure actuelle un frein à la démocratisation de la synthèse de protéines par NCL. Le premier volet de cette thèse décrit la conception et le développement d’une nouvelle méthode bioinspirée de synthèse de précurseurs de peptides thioester, fondée sur un dispositif de thioestérification intramoléculaire de type N-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-cystéine (N-Hnb-Cys). La synthèse des peptides portant ce dispositif a été totalement automatisée à partir de réactifs peu couteux et ne requière pas d’étapes post-SPPS avant la NCL. La conception biomimétique du dispositif –ce dernier opérant via un réarrangement par transfert d’acyle N→S–, résulte en des cinétiques de NCL rapides à pH neutre. Un large éventail de précurseurs de thioester a été synthétisé, ceci nous a permis d’explorer le potentiel et les limites de la méthodologie, tout en soulignant son efficacité même pour des « séquences difficiles » et de longs peptides. Cette approche a été appliquée à la synthèse par ligation d’une gamme représentative de peptides naturels riches en cystéines, issus du venin d’un serpent, de mollusques, de primates ou encore de plantes. En particulier, nous avons décrit la première synthèse d’une Big-défensine (93 acides aminés), issue de l’huitre et dont l’activité biologique est en cours d’évaluation. Par ailleurs, une voie synthétique originale pour accéder à des peptides comprenant une cystéine C-terminale a été proposée. Elle repose sur l’introduction de cet acide aminé par NCL, évitant les réactions secondaires inhérentes aux approches existantes. Nous avons également appliqué notre approche à la synthèse par NCL intramoléculaire du squelette peptidique cyclique de plusieurs produits naturels, avec des rendements remarquables. L’ensemble de nos résultats est extrêmement encourageant pour la généralisation de notre approche.

  • Titre traduit

    Bio-inspired automated synthesis of peptides crypto-thioester for native chemical ligation : application to naturally occurring cysteine-rich peptides


  • Résumé

    Peptide Cα-thioesters play a prominent role in the chemical synthesis of proteins: they are key partners in native chemical ligation (NCL), a reaction that has revolutionized the field. Nonetheless, access to such peptides via the widely used Fmoc-SPPS is still limited to experts. This limitation is currently an obstacle to further popularization of NCL-based protein synthesis. The first part of this thesis describes the design and optimization of a new bio-inspired methodology for the synthesis of peptide thioester precursors, based on an N-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)-cysteine intramolecular thioesterification device (N-Hnb-Cys). Synthesis of peptides bearing this device was fully automated, starting from inexpensive materials. Importantly, no post-SPPS steps are required prior to NCL. The biomimetic design of the device –that operates through an N→S acyl shift–, results in fast NCL kinetics at neutral pH. A broad range of thioester precursors has been synthesized; this allowed us to explore the scope and limitation of the methodology, while stressing its efficiency even for demanding sequences and long peptides. This approach has been applied to the ligation-based synthesis of a representative variety of naturally occurring disulfide-rich peptides (DRP) sequences, from snake venom, molluscs, primates and plants. In particular, we have described the first synthesis of a Big-defensin (93 amino acids), discovered in oyster and whose biological activity is currently under evaluation. Furthermore, an original method for the synthesis of C-terminal cysteine-containing DRP has been proposed. It is based on the introduction of this amino acid through NCL, avoiding side reactions inherent to existing approaches. We have also applied our approach to the intramolecular NCL-based synthesis of the cyclic backbone of several DRP, with remarkable yields. Altogether, our results are extremely encouraging for the generalization of this methodology.


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