The role of NEDD8 pathway in cell invasion and strategies for the use of NEDD8 inhibitors in the clinic

par Lara Bou Malhab

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Dimitri Xirodimas.

Soutenue le 21-10-2016

à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé , en partenariat avec Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire (Montpellier) (laboratoire) .

Le président du jury était Stefano Fumagalli.

Le jury était composé de Dimitri Xirodimas, Stefano Fumagalli, Manuel Rodriguez, Susanne Schmidt.

Les rapporteurs étaient Stefano Fumagalli, Manuel Rodriguez.

  • Titre traduit

    Le rôle de la voie de NEDD8 dans l'invasion cellulaire et le developpement de stratégies pour l'utilisation des inhibiteurs de NEDD8 en clinique


  • Résumé

    Les modifications post-transrationnelles avec les molécules ubiquitine et ubiquitine-like sont des mécanismes essentiels pour la régulation des fonctions protéiques et des voies de signalisations. Les ubiquitine-like molécules comme par exemple NEDD8 jouent un rôle majeur dans la fonction des protéines et sont impliqués dans des maladies humaines comme par exemple les maladies neuro dégénératives. NEDD8 est essentiel pour la survie, la croissance et le développement. C’est pour ceci, l’élucidation de leurs mécanismes d’action est très importante.Dans notre laboratoire, nous nous intéressons à l’ubiquitine-like molécule NEDD8. Le mécanisme de modification avec cette protéine est dit NEDDylation et il nécessite une intervention enzymatique médiées par E1, E2 et E3. Le rôle majeur de NEDD8 est la régulation de l’activité des Cullins, des E3 ubiquitine ligases. Les Cullins sont des scaffolds dont le rôle est de faciliter la dégradation des substrats en assemblant tout le complex enzymatique. La dérégulation de l’activité des Cullins a été montrée de contribuer à l’oncogenèse suite à l’accumulation des oncoprotéines ou suite à la dégradation excessive des suppresseurs de tumeurs. Récemment, la voie de NEDDylation a été ciblée pour des interventions thérapeutiques ; MLN4924 (Provenodistat) (Millenium Pharmaceuticals) bloque la voie de NEDDylation en formant une liaison covalente avec l’enzyme E1 de la voie de NEDDylation. L’identification des mécanismes de régulation des fonctions protéiques par NEDD8 fournira plus d’informations sur le mécanisme d’action de NEDD8 d’un point de vu moléculaire, ce qui permettra l’identification de nouvelles cibles pour de nouvelles interventions thérapeutiques. Dans 50% des tumeurs, le gène p53 est muté. Dans les 50% qui restent, le gène p53 est intact mais la protéine est non fonctionnelles dû à des dérégulations des voies de signalisations. Nous avons trouvé que l’inhibition de la NEDDylation via MLN4924 bloque l’invasion des cellules de mélanomes métastatiques. D’un point de vu moléculaire, MLN4924 provoque la dégradation de Mdmx, l’homologue de Mdm2, tous les deux sont des majeurs régulateurs négatifs de p53. Ceci est dû à la formation d’un complexe entre Mdmx, Mdm2 et Cullin4A inactif. On a démontré que la dégradation de Mdmx est essentielle pour l’activation de la voie RhoA/ROCK capable de bloquer l’invasion tout en modulant le cytosquelette d’actine.De plus, Mdmx a été identifié en tant que régulateur de l’activité de RhoA. Mdmx se lie à la forme inactive de RhoA (GDP-RhoA) et contrôle son activation. Durant les travaux de recherche, nous avons aussi essayé de développer une méthode nous permettant d’utiliser MLN4924 d’une façon spécifique dans le but de minimiser les effets secondaires normalement accompagnant les traitements de chimiothérapies. MLN4924 comme tout agent chimio-thérapeutique, est toxique envers les cellules normales. Dans le but d’utiliser MLN4924 d’une manière spécifique nous permettant de cibler uniquement les cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales, nous avons testé cette molécule dans une approche basée sur le statut de p53 appelé « cyclotherapie ».Nos résultats montrent que l’activation de p53 avec des concentrations minimes d’Actinomycine D, induit un arrêt du cycle cellulaire dans la phase G1, protégeant ainsi les cellules de l’effet toxique de MLN4924. Ceci n’est pas le cas pour les cellules cancéreuses dont p53 est déficient ou sans p53. Celles-ci progressent en phase S où elles seront éliminées par apoptose. Cette combinaison a été aussi testée in vivo, plus spécifiquement en utilisant les zebrafish comme model, ce qui nous a permis de confirmer l’effet protecteur de l’Actinomycine D contre l’effet toxique de MLN4924. Nos résultats constituent une nouvelle possibilité de combinaison de MLN4924 basé sur le statut de p53.


  • Résumé

    Post-translational modifications with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (ubls) are essential regulatory mechanisms of protein function and signalling networks. Ubiquitin-like molecules, such as NEDD8 have emerged as major mechanisms of protein function regulation and implicated in human diseases including cancer and neurodegeneration. It is essential for viability, growth and development. Therefore, the elucidation of their mechanism of action is critical. In our lab, research is focused on NEDD8. The process called NEDDylation, involves the three enzymatic activities (E1, E2 and E3). The well-known role of NEDD8 is the regulation of the activity of E3 ubiquitin ligases called Cullin Ring Ligases through modification of Cullins. Cullins are scaffolds to facilitate E3 ligase complex assembly and mediated substrate degradation. Deregulation of Cullins activity has been shown to contribute to oncogenesis through the accumulation of oncoproteins or excessive degradation of tumour suppressors. Recently, the NEDDylation pathway has been targeted for therapeutic intervention; MLN4924 (Pevonedistat) (Millenium Parmaceuticals) forms a covalent adduct with the NEDD8 E1 enzyme and blocks the NEDDylation cascade. Identification of mechanisms of protein function regulation by NEDDylation will provide the molecular basis for the action of the NEDD8 inhibitors in clinic and potentially identify novel targets for therapeutic intervention. In 50% of tumours the TP53 is mutant. In cancer cells where TP53 is WT, upstream or downstream signalling pathways are deregulated. We found that inhibition of NEDDylation by MLN4924 dramatically blocks invasion of metastatic melanoma cells. At the molecular level, MLN4924 induces proteasomal degradation of the Mdmx oncogene product, a key negative regulator of the p53 tumor suppressor. Mechanistically, MLN4924 induces the complex formation of Mdmx with Mdm2 and inactive Cullin4A that promote Mdmx degradation. We found that the degradation of Mdmx is required for the activation of the RhoA/ROCK pathway which blocks cell invasion through changes in the cell cytoskeleton. Interestingly, Mdmx was identified as regulator of RhoA activity through binding with inactive RhoA (GDP- bound RhoA). Another question was addressed which is how to use MLN4924 in a specific manner, thus reducing side effects usually resulting from chemo treatments. MLN4924 as all chemo-agents, is toxic towards healthy cells. In order to use MLN4924 in a specific manner targeting cancer cells specifically leaving healthy cells unharmed, a p53 based cyclotherapy was tested. Our results show that low activation of wild type p53 by low doses of Actinomycin D, causes a G1 cell cycle arrest and protects normal cells from MLN4924 treatment leaving cancerous cells with mutant p53 or no p53 to progress to S-phase and selectively commit apoptosis upon MLN4924 treatment. Our protocol was tested in vivo, in zebrafish model system confirming the protective effect of LDACTD against the cytotoxic effect of MLN4924. Our results provide a possible combination therapy for MLN4924 based on the p53 status.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire. Section Médecine-Unité pédagogique médicale.
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.