The mycolic acid dehydratases in mycobacterium abscessus : contribution to pathogenicity and potential drug targets

par Iman Halloum

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Laurent Kremer.

Le président du jury était Stéphane Canaan.

Le jury était composé de Laurent Kremer, Stéphane Canaan, Andrès Floto, Jean-Luc Mainardi, Jean-Louis Herrmann, Annette C. Vergunst.

Les rapporteurs étaient Andrès Floto, Jean-Luc Mainardi.

  • Titre traduit

    Les déshydratases des acides mycoliques chez mycobacterium abscessus : contribution à la pathogénicité et cibles thérapeutiques potentielles


  • Résumé

    Mycobacterium abscessus est une mycobactérie à croissance rapide qui a récemment émergé en tant que pathogène opportuniste, en particulier chez les patients atteints de mucoviscidose. Elle est naturellement résistante aux antibiotiques les plus couramment disponibles, limitant sérieusement les options thérapeutiques chez les patients infectés. Il apparaît donc urgent d’identifier et de caractériser de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique dans la lutte contre ce pathogène. Contrairement au variant lisse (S) de M. abscessus, caractérisé par une forte production de glycopeptidolipides (GPL), le variant rugueux (R) associé à une faible production de GPL est responsable des manifestations cliniques les plus sévères. Chez l’embryon de poisson zèbre, le variant R s’accompagne d’une virulence accrue avec formation de cordes mycobactériennes extracellulaires et d’abcès, engendrant une mortalité rapide des larves infectées. Les mécanismes moléculaires de la pathogénicité de M. abscessus demeurent toutefois très peu connus.Dans cette étude, nous avons identifié le gène MAB_4780, codant une déshydratase distincte du complexe HadABC impliqué dans la biosynthèse des acides mycoliques. Le gène MAB_4780, tout comme son homologue chez M. smegmatis, MSMEG_6754, ont été identifiés comme responsables de la résistance innée de ces deux espèces au thiacetazone (TAC), un agent antituberculeux de seconde intention. Nous avons inactivé le gène MAB_4780 dans le variant R de M. abscessus, ce qui a entraîné une modification de la composition en acides mycoliques, un défaut de formation des cordes mycobactériennes ainsi qu'un phénotype extrêmement atténué chez les embryons de poisson zèbre. L'atténuation in vivo du mutant MAB_4780 qui résulte très vraisemblablement de l’incapacité i) à former des cordes et ii) à inhiber la fusion phagolysosomale, s’accompagne d’une croissance intracellulaire diminuée. En outre, le mutant MAB_4780, tout comme le mutant de M. smegmatis dépourvu de MSMEG_6754, présente une croissance altérée dans l’amibe, qui représente un réservoir pour les mycobactéries environnementales. Ces résultats reflètent le rôle crucial de cette nouvelle déshydratase dans la survie de M. abscessus dans son environnement et dans l'établissement d'infections aiguës et létales. Par conséquent, cibler MAB_4780 pourrait représenter une stratégie particulièrement prometteuse pour contrôler les infections à M. abscessus. De futures études seront consacrées à l'identification d’inhibiteurs spécifiques de MAB_4780, grâce au développement d’un test d’activité et d’une structure cristalline de la protéine obtenue à très haute résolution.Nous avons également criblé contre M. abscessus une chimiothèque d’analogues structuraux du TAC, préalablement validés pour leur activité inhibitrice de la déshydratase HadABC de Mycobacterium tuberculosis. Trois d’entre eux ont montré une efficacité accrue d’un facteur 50 par rapport à la molécule parentale. La surexpression d’EthA, l’activateur du TAC, augmente la susceptibilité de M. abscessus à ces trois analogues. Ces résultats suggèrent que leur mode d'activation est similaire à celle de la TAC et indiquent que l'optimisation d’analogues du TAC pourrait conduire à une nouvelle génération de composés plus efficaces pour le traitement de M. abscessus. Des études de relations structure/activité sont envisagées afin d’améliorer l’efficacité et les propriétés pharmacologiques des analogues du TAC.


  • Résumé

    Mycobacterium abscessus, a rapidly-growing mycobacterium (RGM), has emerged in recent years as an important opportunistic pathogen especially in cystic fibrosis (CF) patients. M. abscessus is naturally resistant to most commonly available antibiotics, which seriously limits the treatment options, emphasizing the urgent need for more efficient drugs and innovative therapeutic strategies to combat M. abscessus infections. The M. abscessus rough (R) low-glycopeptidolipids (GPL) producer is responsible for more severe clinical infections than the smooth (S) high-GPL producer, and is associated with increased virulence in zebrafish, including the formation of massive serpentine cords, abscesses, and rapid larval death. However, the molecular mechanisms responsible for the pathogenicity of the R strains remain elusive.Herein, we identified a novel gene, MAB_4780, encoding a dehydratase distinct from the HadABC complex, known to participate in mycolic acid biosynthesis. Both MAB_4780 and its homologue in Mycobacterium smegmatis, MSMEG_6754, are responsible for the innate resistance in these species to thiacetazone (TAC), a second-line antitubercular drug. The successful deletion of MABS_4780 in the R variant of M. abscessus resulted in an altered mycolic acid composition, a pronounced defect in cording, and an extremely attenuated phenotype in zebrafish embryos. The in vivo attenuation of the MAB_4780 mutant results from both the deficiency in cord formation and the impaired intracellular growth, presumably due to limited inhibition of the phagolysosomal fusion events. In addition, similarly to the MSMEG_6754 deletion mutant, the MAB_4780 mutant showed impaired growth in amoeba, which represents a possible reservoir for environmental mycobacteria. These results reflect the critical role of this new dehydratase in the survival of M. abscessus in its environmental hosts and its importance in establishing acute and lethal infections. Therefore, targeting MAB_4780 may represent a promising strategy to control M. abscessus infections. Future work will focus on identifying specific inhibitors targeting MAB_4780, which could greatly benefit from the combination of our dehydratase assay and our high-resolution crystal structure of the protein.We have also screened against M. abscessus a library of TAC analogues, previously validated for their inhibitory effects against the Mycobacterium tuberculosis HadABC dehydratase. Among these compounds, three exhibited a 50-fold increased potency as compared to TAC. Overexpression of EthA, known as the activator of TAC, increased the susceptibility of M. abscesuss to the three analogues, suggesting that that their mode of activation is similar to that of TAC. Overall, these data indicate that optimizing the TAC scaffold may lead to more efficient compounds against M. abscessus. Additional structure/activity relationship studies are required to further improve the efficacy and pharmacological properties of TAC analogues.

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