Rôle fonctionnel des longs ARN non codants dans l'adaptation et la pluripotence des cellules souches en culture.

par Julien Bouckenheimer

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Thierry Lavabre-Bertrand et de John De Vos.

Le président du jury était Cécile Martinat.

Le jury était composé de Thierry Lavabre-Bertrand, John De Vos.

Les rapporteurs étaient Fabrice Lavial.


  • Résumé

    Les applications des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) dans le domaine biomédical sont particulièrement prometteuses, aussi bien au niveau expérimental qu’au niveau clinique. Leur utilisation comme source inépuisable de cellules permettant de tester et développer de nouvelles molécules thérapeutiques (notamment par modélisation de pathologies in vitro, criblage haut-débit et tests de cytotoxicité) s’ajoute à l’important potentiel qu’elles présentent en médecine régénérative et en thérapie cellulaire. Utilisables comme matériel biologique permettant de restaurer partiellement ou totalement un organe ou un tissu défaillant, il reste essentiel de vérifier l’intégrité génétique des lignées cellulaires utilisées afin de garantir une utilisation sécurisée pour le patient. Parmi les facteurs responsables de l’apparition d’anomalies génétiques chez les CSP, les conditions cultures jouent un rôle essentiel. Des techniques de culture inadaptées peuvent facilement provoquer l’émergence d’une instabilité génomique. Toute altération doit être détectée et documentée afin de pouvoir définir des critères d’acceptation préalable à leur utilisation clinique.Les CSP sont des cellules particulièrement sensibles au stress qui peut résulter de techniques de repiquage inappropriées. La dérive génétique qui découle de ce stress peut être précoce et apparaître dès les premiers passages des lignées cultivées. Notre équipe a pu tester de nombreuses méthodes de repiquage sur différentes lignées cellulaires pluripotentes. Nous avons notamment observé que des anomalies génétiques majeures caryotypiques (trisomies) et infra-caryotypiques (SNPs) ainsi que des changements phénotypiques (survie augmentée, acquisition de mobilité) apparaissaient rapidement suite à l’utilisation de techniques de repiquage basées sur l’utilisation d’enzyme de dissociation (TryPLE). Ces altérations apparaissent dans des lignées qui s’adaptent progressivement à la dissociation en cellules uniques (dissociation « single-cell ») provoquées par ces enzymes.Notre équipe étudie les conséquences cellulaires liées à ce phénomène d’adaptation des CSP provoquée par la dissociation « single-cell ». Grâce à des techniques de séquençage dernière génération (RNA-Seq), nous avons comparé les profils transcriptomiques de CSP repiquées par des techniques standard (comme le passage mécanique) et par des techniques basées sur la dissociation « single-cell » (comme le passage enzymatique par TryPLE). Cette comparaison a montré au niveau transcriptionnel une surexpression spectaculaire d’ARNs non codants appartenant à une classe récemment décrite : les longs ARNs non codants (lncRNAs).L’objectif principal de ce travail de thèse a été d’évaluer le niveau d’implication de ces lncRNAs dans le processus d’adaptation des CSP en culture, et leur rôle fonctionnel potentiel. Nous avons ainsi dans un premier temps déterminé in silico quels lncRNAs étaient différentiellement exprimés dans les CSP adaptées, et après validation expérimentale par biologie moléculaire des candidats les plus prometteurs, nous avons utilisé des tests fonctionnels (notamment par RNA interférence (siRNA)) afin de déterminer le rôle de ces lncRNAs dans la machinerie cellulaire et la pluripotence des CSP. Autour de ce projet principal, nous avons essayé de comprendre les mécanismes régissant les changements phénotypiques et comportementaux provoquées par la dissociation « single-cell ». Nous avons notamment pu suggérer la mise en place d’un phénomène de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) chez des CSP dissociées. Enfin, l’attractivité que représente un sujet d’étude récent comme les lncRNAs et la disponibilité croissante de publications les concernant nous ont poussé à publier une revue approfondie ainsi qu’une méta-analyse sur l’implication des longs ARN non codants dans le développement précoce de l’embryon et dans les cellules souches pluripotentes.

  • Titre traduit

    Functional roles of long non coding RNAs in pluripotency and adaptation of stem cells in culture.


  • Résumé

    The actual and future applications of human pluripotent stem cells (PSC) in the biomedical field are highly promising. Their use for the discovery of new therapeutic drugs through the development of high-throughput screening tests, cytotoxicity tests and in vitro disease modeling has been added to their tremendous interests in regenerative medicine and cellular therapy. As a source of biological material that can be used to restore partially or totally the lost functions of a damaged organ or tissue, or as a source of normal cells to study human development or test putative new drugs, their genomic integrity has to be thoroughly assessed. Therefore, an effective optimization of their culture conditions has to be considered, in order to control the absence of genomic instability and prevent their potential emergence. Any genetic or epigenetic alteration resulting from cell culturing must be detected in order to define and characterize acceptance criteria for scientific and medical purposes.PSC are particularly sensitive to stress resulting from unappropriated passaging techniques, which cause rapid genetic drift. Indeed, our team observed that many genomic abnormalities arise from aggressive single cell, enzymatic based, passaging methods, and that substantial phenotypical changes such as increased survival after cell dissociation and variation in cell shape can then occur.In order to understand the mechanisms governing the emergence of those adverse alterations, the team focused on the consequences resulting from the adaptation of PSC to single-cell dissociation. By using new generation sequencing techniques as RNA-Seq, we compared transcriptomics of PSC passaged by standard techniques (such as mechanical passaging) versus single-cell enzymatic dissociation (such as TRyPLE-based single-cell passaging). This comparison showed that the most striking difference in the gene expression pattern between adapted and non adapted cells concerned the dramatic overexpression of RNAs from a recently discovered class: long non-coding RNAs (lncRNAs).The aim of this thesis work was to determine to which extent some of these lncRNAs were functionally linked to adaptation of PSC. In order to address this matter, we first investigated in silico which lncRNAs were upregulated by single-cell dissociation, and after experimental validation of lncRNA candidates by molecular biology, we performed functional in vitro analysis (notably by siRNA-mediated loss of function) and sought their cellular localization in order to decipher their role in the cellular machinery and their level of implication. Beside this main project, other auxiliary projects were grafted. The observation of major changes in cell phenotype and behavior led to the investigation of the global mechanisms governing these modifications, underlining the potential role of epithelial-to-mesenchymal transition provoked by single-cell dissociation. Finally, the global attractiveness of lncRNAs and the emergence of exponential documentation concerning non-coding RNAs prompted the writing of an extensive review and meta-analysis concerning the implications of lncRNAs during embryo development and in pluripotent stem cells.

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