Exploration de l'origine de la robustesse de la dynamique d'expression d'AGAMOUS pendant le développement de la fleur en utilisant une approche pluridisciplinaire

par Samuel Collaudin

Thèse de doctorat en Sciences de la Vie

Sous la direction de Pradeep Das.

Soutenue le 02-12-2016

à Lyon , dans le cadre de École Doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon) , en partenariat avec École normale supérieure de Lyon (établissement opérateur d'inscription) et de Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes (1993-....) (laboratoire) .


  • Résumé

    L'identité des organes floraux est définie par l’expression de gènes homéotiques appartenant à la famille des MADS-box au début du développement floral. Un de ces gènes, AGAMOUS (AG), est responsable de l’identité des étamines et des carpelles chez Arabidopsis thaliana. Dans ce manuscrit, je tente de comprendre les propriétés spatiales et temporelles de l’expression d’AG en cherchant à connaître les mécanismes impliqués dans le bon établissement de la dynamique d’expression d’AG pendant les jeunes stades du développement floral.Je débute par développer un modèle de réaction-diffusion qui prend en compte la croissance de la fleur pendant les stades d’intérêt, ainsi que quelques facteurs de transcriptions clefs impliqués dans la régulation d’AG. Ensuite j’ai imagé en direct et en 4D la croissance des fleurs pour quantifier l’activation de l’expression d’AG de son initiation à son patron d’expression stable. Je montre que son expression se déroule en deux phases: une phase de faible expression, et une phase de forte expression. Bien que toutes les cellules du dôme central de la fleur présentent un profil d’activation d’AG similaire, le temps précis au cours du développement où AG est activé est différent pour chacunes d’entre elles et est à l’origine de la stochasticité du patron d’expression. Avec l’aide du modèle, je propose quatres nouvelles hypothèses relatives à la régulation d’AG :AG est capable de maintenir sa propre activation en se liant directement à son second intron au travers d’un complexe protéique contenant au moins deux molécule d'AG, créant ainsi un seuil d'auto-activation.AP2 influence la valeur de ce seuil, restreint l’expression d’AG dans le dôme central de la fleur et produit un retard dans l’activation complète d’AG.LFY et WUS sont nécessaire à l’accumulation des protéines d’AG dans les cellules pour pouvoir atteindre le seuil d’auto-activation et obtenir une expression complète d’AG.Le mouvement d’AG est nécessaire pour obtenir l’expression d’AG dans toutes les cellules du dôme central. Pour prouver ces hypothèses, j’ai réalisé différentes expériences. En premier, utilisant une expérience de FRET-FLIM dans les protoplastes, nous proposons qu’AG est capable de s’associer en homodimer dans les cellules végétales. Néanmoins, sur-exprimer AG pour aider les cellules à atteindre le seuil d’auto-activation plus tôt que dans la plante sauvage ne semble pas modifier la dynamique d’expression de l’AG endogène. En deuxième, j’ai testé le rôle précis de LFY au cours des différentes phases et transitions de la dynamique d’expression d’AG en mutant les sites d'interactions spécifiques pour LFY au sein des séquences de régulation d’AG. Ces mutations retardent l’expression l’expression d’AG et modifient légèrement son patron d’expression. Je montre que seulement d’important retards dans l’activation d’AG induit des modifications phénotypiques. Ensuite, pour tester le rôle de la répression par AP2 dans la dynamique d’expression d’AG, j’analyse le rapporteur d’AG dans le contexte d’un mutant fort d’ap2. Dans ce mutant, l’expression d’AG s’étend à une région plus large et le retard entre l’initiation de l’expression d’AG et la transition entre les phases de faible et forte expressions est diminué. Ces résultats correspondent aux simulations du modèle. Finalement, pour comprendre l’importance du mouvement d’AG d’une cellule à l’autre dans sa propre dynamique, je bloque cette capacité de bouger en utilisant un tag de localisation nucléaire. Bien que cela induit un retard dans l’activation de quelques cellules au stade 3 au moment où toutes les cellules du dôme centrale de la fleur expriment AG dans la plante sauvage, ce retard n’a pas d’effets visible sur le phénotype.

  • Titre traduit

    Exploring the basis of robust AGAMOUS expression dynamics during flower development using a pluridisciplinary approach


  • Résumé

    The identity of flower organs is defined by the expression of homeotic genes during early development that belongs to the MADS-box family. One of these genes, AGAMOUS (AG), is responsible for the identity of the stamens and the carpels in Arabidopsis thaliana. In this manuscript, I attempt to fully understand the spatial and temporal properties of AG expression by investigating the mechanisms underlying the proper establishment of AG expression dynamics during the early stages of flower development. I start by developing a reaction-diffusion model that takes into account the growth of the flower at the relevant stages, as well as the few key transcription factors involved in AG regulation. Next I used real-time 4D imaging on growing flowers to quantify the activation of AG expression from its onset to the stable pattern. I show that the AG expression occurs in two phases: a low-expression phase and a high-expression phase. Thus although all cells of the central dome of the flower present similar profiles of AG activation, the precise developmental time at which AG is activated is different in each case, and is the origin of the initial stochastic pattern. With the aid of the model, I also propose four new hypotheses to explain AG regulation: AG is able to maintain its own activation by directly binding its own second intron through a protein complex containing at least two molecules of AG leading to the creation of an auto-activation threshold.AP2 influences the value of this threshold, restraining AG expression to the central dome of the flower and producing a delay in complete AG activation.LFY and WUS are necessary to accumulate AG proteins in cells in order to reach the auto-activation threshold and obtain a full expression of AG.AG movement is necessary to obtain expression of AG in every cell of the central dome. To prove these hypotheses, I have carried out various experiments, using FRET-FLIM in protoplast cells, we suggest that AG is able to form homo-dimers in plant cells. However, overexpressing AG to help cells reach the auto-activation threshold earlier than in the wild-type does not appear to alter the endogenous AG dynamics of expression. Secondly, I test the precise role of LFY in the different phases and transitions in the AG expression dynamics by mutating specific interaction sites for LFY within AG regulatory sequences. These mutations appear to delay AG expression and slightly modify its pattern of expression. I show that only important delays in AG activation induce phenotypic differences. Then, to test the role of AP2 repression in AG expression dynamics, I analyse the AG reporter in the context of a strong ap2 mutant. In these mutants, AG expression spreads to a wider region and reduces the delay between the onset of AG expression and the transition from low- to high-expression. These results match with simulations of the model. Lastly, to understand the importance of AG cell-to-cell movement in AG dynamics, I block its ability to move using a nuclear localisation tag. Although this induces a delay in the activation of few cells at stage 3, when all cells of the central dome of the flower express AG in the WT. This delay has no visible effects on the phenotype.



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