Expanding the Tribolium toolkit : CRISPR-based techniques to investigate cell fates in a short germ embryo

par Anna Friederike Gilles

Thèse de doctorat en Sciences de la vie

Sous la direction de Michalis Averof.

Soutenue le 30-11-2016

à Lyon , dans le cadre de École Doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon) , en partenariat avec Université Claude Bernard (Lyon) (établissement opérateur d'inscription) et de Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon (laboratoire) .

Le président du jury était Patrick Lemaire.

Le jury était composé de Michael Akam, Bénédicte Durand, Muriel Grammont.

Les rapporteurs étaient Evelyn Houliston.

  • Titre traduit

    Extension de la boîte à outils de Tribolium : technique basée sur CRISPR pour étudier le destin de cellules dans un embryon de type "short germ"


  • Résumé

    Un objectif important de la biologie du développement est de comprendre la base cellulaire de la morphogenèse, notamment le destin des différentes cellules souches dans l'embryon en développement. En décrivant la morphogenèse des espèces représentatives des différents groupes ou embranchements, on fournit une base solide pour comparer les processus similaires dans les différents organismes, et pour tirer des conclusions sur l'évolution des plans d'organisation des animaux. À cette fin, les scientifiques développent des techniques chez des espèces sélectionnées - celles-ci comprennent la manipulation de la fonction des gènes, le marquage et le suivi des populations distinctes de cellules, et l'imagerie in vivo.Dans cette thèse, je présente mes efforts pour améliorer la boîte à outils génomique du coléoptère Tribolium castaneum. J'utilise une technique d'édition du génome récemment découverte, CRISPR/Cas, pour introduire des modifications précises dans le génome de Tribolium, y compris l'introduction de grands fragments par recombinaison homologue. Je montre que l'expression de tous les composants de CRISPR/Cas est induite de manière efficace par des promoteurs endogènes de Tribolium. En me basant sur ces résultats, je développe VALCYRIE, une approche transgénique pourmarquer des clones de cellules uniques dans l'embryon de Tribolium.Ce travail me permet d'enquêter sur le devenir des cellules dans la région terminale postérieure du blastoderme de Tribolium. En utilisant une approche de marquage clonal, je montre que ces cellules donnent naissance à des cellules germinales primordiales et aumésoderme postérieur. Avec la même méthode, je montre que l'intestin postérieur de Tribolium se développe à partir d'une population distincte de cellules au début de la bandelette germinale. En utilisant une technique de microscopie timelapse haute résolution, je décris le sort de cellules individuelles dans le blastoderme de Triboliumet je fais la lumière sur le plan de développement des segments gnathal et thoracique de l'embryon à ce stade. En outre, je montre que l'amnios de Tribolium augmente considérablement au cours du développement précoce. En me basant sur des données d'imagerie, je passe en revue la cartographie du devenir de la bandelette germinale en ce qui concerne l'amnios et l'ectoderme embryonnaire


  • Résumé

    An important objective of developmental biology is to understand the cellular basis of morphogenesis, including fates of distinct progenitor cells in the developing embryo. Describing morphogenesis in representative species of different groups or phyla provides a solid basis for comparing similar processes in different organisms, and for drawing conclusions about the evolution of animal body plans. To this end, scientists develop techniques in selected species - these include manipulation of gene function, marking and tracking of distinct populations of cells, and in vivo imaging.In this thesis, I present my efforts to enhance the genomic toolkit of the beetle Tribolium castaneum. I use a recently discovered genome editing technique, CRISPR/Cas, to introduce precise alterations in the Tribolium genome, including the introduction of large fragments by homologous recombination. I show that all CRISPR/Cas components are driven efficiently by endogenous Tribolium promoters. Based on these results, I develop VALCYRIE, a transgenic approach to mark single cell clones in developing Tribolium embryos.This work allows me to investigate the fates of the cells in the posterior terminal region of the Tribolium blastoderm. Using a clonal labeling approach, I demonstrate that these cells give rise to primordial germ cells and posterior mesoderm. With the same technique, I demonstrate that the hindgut of Tribolium develops from a distinct cell population in the early germband. Using high-resolution time lapse microscopy, I describe the fates of single cells in the Triboliumblastodermand shed new light on the fatemap of gnathal and thoracic segments of the embryo at this stage. Furthermore, Ishow that the amnion of Tribolium expands greatly during early development. Based on imaging data, I review the fate map of the early germ band with regard to the amnion and the embryonic ectoderm

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