La biologie structurale des polykétide synthases de type trans-AT

par Jonathan Dorival

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Kira Weissman et de Arnaud Gruez.

Le président du jury était Benoît Guillot.

Le jury était composé de Mirjam Czjzek.

Les rapporteurs étaient Peter F Leadlay, Véronique Receveur-Bréchot.


  • Résumé

    Les polykétides sont des molécules complexes possédant des rôles thérapeutiques divers (antibiotiques, anticancéreux, immunosuppresseurs, etc..). Ces composés sont synthétisés par les polykétides synthases (PKS) qui présentent donc un intérêt certain. Une stratégie prometteuse et en développement, appelée biologie synthétique, consiste en l’ingénierie protéique des PKS pour produire de nouveaux polykétides. Cependant, un prérequis au succès de cette méthode est la compréhension du fonctionnement des PKS. En effet, les PKS sont des systèmes complexes composés de plusieurs sous-unités. Celles-ci comportent chacune un ou plusieurs modules responsable d’un cycle d’extension du polykétide. Les modules sont composés également de plusieurs domaines assurant chacun un rôle biosynthétique. Il est ainsi nécessaire de comprendre comment s’opère la communication entre domaines au sein d’un module. Pour cela, nous avons étudié le module 5 de la PKS synthétisant la virginiamycine M par une approche combinant la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la modélisation par homologie. Ainsi nous sommes parvenus à caractériser la structure en solution du module 5, mais également à positionner les structures à haute résolution des domaines à l’intérieur de l’enveloppe SAXS. De plus, notre étude de la dynamique du module 5 a montré que les deux domaines acyl carrier protein (ACP) composant le module semblent non-équivalents, et que l’ACP5b doit être doté d’une certaine mobilité afin d’être fonctionnel, ceci dû à la flexibilité du linker reliant les deux ACP. L’interaction entre les sous-unités consécutives est également primordiale pour assurer la fidélité de la synthèse des polykétides. Ces interactions sont assurées, au moins en partie, par des domaines de petite taille appelés « domaine de docking (DD) ». Jusqu’alors, les DD avaient été caractérisés uniquement chez les PKS de type cis-AT. Nous avons caractérisé une nouvelle classe de DD, la première chez les PKS trans-AT. Grâce à une approche pluridisciplinaire, nous avons montré que l’un des DD constitue probablement une protéine intrinsèquement désordonnée (IDP) : son interaction avec le DD partenaire induirait son repliement. Nous avons résolu la structure RMN d’une protéine de fusion entre les deux DD, affichant une nouvelle topologie pour une interaction protéine-protéine. Cette interface de docking a ensuite été replacée dans son contexte modulaire par SAXS. Contrairement aux autres DD qui ne forment qu’une seule interface de docking, ces DD forment deux complexes de docking à l’intersection des deux sous-unités. Nos données SAXS nous avons également permis de proposer un modèle de l’interface créée entre deux sous-unités PKS dans laquelle une chambre réactionnelle est formée, qui pourrait servir à protéger des intermédiaires réactifs de polykétide. Des enzymes post-PKS interviennent suite à la synthèse du polykétide pour maturer ce dernier. Cette étape est d’une importance considérable puisqu’elle confère la structure et l’activité finale du polykétide. Dans ce contexte, nous avons mené une étude structure/fonction de l’enzyme post-PKS catalysant la macrocyclisation de l’antibiotique lankacidine C. Après un phasage par SAD sur la protéine séléniée, nous avons résolu la structure de l’enzyme en complexe avec des analogues de substrats, puis procéder à la conception de mutants pour résoudre la structure de l’enzyme avec son substrat naturel

  • Titre traduit

    Structural biology of trans-AT polyketide synthase


  • Résumé

    Polyketides are structurally complex molecules which exhibit diverse therapeutic activities (antibiotic, antitumor, immunosuppressant…). These compounds and the enzymes responsible for their synthesis, the polyketide synthases (PKSs), are thus of significant biomedical interest. An emerging though promising strategy for the generation of novel polyketides is the engineering of the PKS proteins, an approach called synthetic biology. Nevertheless, a fundamental understanding of the mode of operation of the PKS enzymes is directly correlated with the success of this methodology. Indeed, PKSs are molecular-scale assembly lines which are composed of several subunit, each of which includes one or several modules catalyzing a polyketide elongation cycle. The module themselves are composed of several domains each with a specific role in the biosynthesis. It is therefore necessary to understand how the domains within a module communicate with each other. To address this question, we studied module 5 of the PKS responsible for virginiamycin M using an approach combining small angle X-ray scattering (SAXS), nuclear magnetic resonance (NMR) and homology modeling. This strategy allowed us to characterize the solution structure of module 5, but additionally to position high-resolution domain structures inside the SAXS envelopes. We also studied the dynamics of module 5, demonstrating that the two component acyl carrier proteins (ACPs) appear to be non-equivalent, and that the function of ACP5b is likely dependent on the mobility conferred on it by the flexible linker between the two domains. The interaction between the consecutive subunits is also critical to ensuring the fidelity of polyketide synthesis. This communication is assured, at least in part, by small domains called docking domains (DD), which have to date only been characterized from cis-AT PKS. Here, we have identified a new class of DD, the first shown to be present in trans-AT PKSs. Using a multidisciplinary approach, we have demonstrated that the N-terminal DD (VirFG NDD) is likely to be an intrinsically disordered protein (IDP), whose interaction with its partner DD (VirA CDD) induces its folding. We have solved the NMR structure of a fusion protein between the two DD, revealing a new topology for a protein-protein interaction. This docking interface was then placed into its modular context by SAXS. In contrast to the other classes of DD which form a single docking complex, this new type of DD gives rise to two docking interfaces at the intersubunit junction. Finally, our SAXS data have allowed us to propose a model for the complete interface between two PKS subunits in which a reaction chamber is formed, which may allow reactive polyketide intermediates to be protected. Post-PKS enzymes catalyze maturation of the polyketide after its release from the last module of the PKS. This processing is critical as it yields the final structure and activity of the polyketide. In this context, we conducted a structure/function study of the post-PKS enzyme catalyzing the macrocyclisation of the antibiotic lankacidine C. After phasing by SAD using a seleniated protein, we solved the structure of the enzyme in complex with substrate analogues. We then proceeded to site-directed mutagenesis of specific residues, in order to solve the structure of the enzyme in complex with its natural substrate


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