Optimization and scale-up production process of 2,3-butadeniol from maltodextrin by metabolically engineered klebsiella oxytoca KMS005

par Sitha Chan

Thèse de doctorat en Génie Mécanique, Mécanique des Matériaux

Sous la direction de Patricia Taillandier et de Claire Joannis Cassan.

Le président du jury était Behnam Taidi.

Le jury était composé de Patricia Taillandier, Claire Joannis Cassan, Behnam Taidi, Alissara Reungsang, Kaemwich Jantama.

Les rapporteurs étaient Behnam Taidi, Alissara Reungsang.

  • Titre traduit

    Optimisation et scale-up du procédé de production de 2,3-butanediol à partir de maltodextrine par Klebsiella oxytaca génétiquement modifiée KMS005


  • Résumé

    L'optimisation des procédés utilisant un substrat bon marché et abondant est considéré comme un facteur affectant le prix de production du 2,3-BD. Les valeurs optimales du pH, du taux d'aération, de la vitesse d'agitation, et de la concentration en substrat (maltodextrine) pour la production de 2,3-BD à partir de maltodextrines par la souche génétiquement modifiée Klebsiella oxytoca KMS005 ont été déterminées par une méthode conventionnellefacteur par facteur ainsi que par l’utilisation de la méthode des surfaces de réponse avec un plan d’expériences de Box-Behnken. Les résultats ont montré que les valeurs optimales de pH, taux d'aération, vitesse d'agitation, et concentration en substrat (maltodextrine) ont été respectivement de 6,0, 0,8 wm, 400tr/min et 150 g/L. Les surfaces de réponses ont permis de montrer que la vitesse d'agitation était le paramètre le plus influent pour la production de 2,3-BD. La mise en oeuvre d’un procédé fed-batch a permis d’obtenir en 78 h une concentration en 2,3-BD de 88,1±0,2 g/L avec un rendement de 0,412±0,001 g/g et une productivité de 1,13±0,01 g/L/h. L’influence des conditions de micro-aération sur la croissance des microorganismes et sur la production de 2,3-BD a été étudiée. En bioréacteurs batch, le transfert d’oxygène a été caractérisé via la mesure kLa en faisant varier le débit d'air et la vitesse d'agitation. La quantité optimale d'oxygène fournie aété évaluée à 9,5 g correspondant à un kLa de 25,2 h-1. Ensuite, un Ensuite, un procédé fed-batch a été étudié avec différentes stratégies de débit d'alimentation en glucose. Les meilleurs résultats ont été obtenus pour un débit d'alimentation constant en glucose de 2 g/h après une phase batch de croissance de 48 heures, et suivie d'une phase batch finale de 40 heures. Il en est résulté une concentration finale de 2,3-BD de 74,7 g/L avec une productivité de 0,64 g/L/h et peu de sous-produits formés (environ 3 g/L d’acide succinique, acétate et éthanol). D’autre part, les résultats issus des expérimentations en bioréacteur de 2 L ont été mis en oeuvre à l’échelle pilote. La production de 2,3-BD de maltodextrine a été réalisée dans des bioréacteurs de 10, 90 et 300 L pour différentes vitessesd’agitation et un taux d'aération fixé à 0,8 vvm.). Une concentration de 2,3- BD de 53,8 g/L et un rendement de 0,40 g/g de sucre consommé en 48 hont été obtenus avec une vitesse d’agitation constante de 295 tr/min en réacteur de 10 L. Pour le réacteur de 90 L, une concentration en 2,3-BD de52,53 g/L et un rendement de 0,43 g/g de sucre consommé ont été atteints en 72 h pour une vitesse d’agitation constante à 130 tr/min. Les meilleuresconditions d’inoculation ont été obtenues pour les précultures en phase exponentielle de croissance (12 h d’incubation) et une DO550 égale à 4 avant transfert dans le bioréacteur de 90 L. Pour le réacteur de 300 L, la concentration en 2,3-BD était de 45,02 g/L pour un rendement de 0,43 g/g de sucre consommé, obtenusaprès 72 h.


  • Résumé

    An optimization process with a cheap and abundant substrate is considered one of the factors affecting the price of commercial 2,3-Butanediol (2,3-BD) production. The optimized levels of pH, aeration rate, agitation speed, and substrate concentration (maltodextrin)were optimized by a conventional method and Response Surface Methodology (RSM) with Box-Behnken design in which metabolically engineered Klebsiell oxytoca KMS005 utilized maltodextrin to produce 2,3-BD. Results revealed that pH, aeration rate, agitation speed,and maltodextrin concentration at levels of 6.0, 0.8 vvm, 400 rpm, and 150 g/L, respectively, were the optimal conditions. RSM indicated that the agitation speed was the most influential parameter when either agitation and aeration interaction or agitation and substrate concentrationinteraction played important roles for 2,3-BD production. Under interim fedbatch fermentation, 2,3-BD concentration, yield, and productivitywere obtained at 88.1±0.2 g/L, 0.412±0.001 g/g sugar supplied, and 1.13±0.01 g/L/h, respectively, within 78 h. The influence of micro-aerobicconditions on microbial growth and 2,3-BD production was also studied. In batch bioreactors, air flow rate and agitation rate characterized through kLa measurement were tested. The optimal amount of oxygen supply was evaluated at 9.5 g corresponding to a kLa of 25.2 h-1 for cell growth and 2,3-BD production. Then, a fed-batch process was investigated by different glucose feeding rate strategies. Fedbatch with a glucose feeding rate of 2 g/h starting at the end of the growth phase during 48 h, followed by a final batch phase of 40 h was found satisfactory. It resulted in a final 2,3- BD concentration of 74.7 g/L with a productivity of 0.64 g/L/h but few byproducts formed (about 3 g/L including succinate, acetate and ethanol). Validated information in the 2 L bioreactor was further applied in a larger scale production of 2,3-BD with series of bioreactors from 10, 90 and 300 L vessels. Batch experiments were conducted based on various agitation speeds with the fixedaeration rate at 0.8 vvm. As a result, 2,3-BD concentration, and yield were achieved at 53.8 g/L, and 0.40 g/g sugar supplied within 48 h, respectively, under the constant tip speed at 295 rpm using a 10 L vessel. Its concentration of 52.53 g/L and yield of 0.43 g/g sugar consumedwithin 72 h were attained under the condition of the constant tip speed at 130 rpm using a 90 L fermenter. An appropriate seed inoculum condition was found with an optical cell density (OD550) around 4 at the log phase (12 h incubation) prior to transferring of the inoculum into the 90 L fermenter. Under the constant tip speed at 70 rpm, 2,3-BD concentration and yield were obtained at 45.02 g/L and 0.43 g/g sugar consumed in the pilot scale of 300 L bioreactor after 72 h incubation.


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