Développements instrumentaux pour le contrôle de la cristallisation par la dialyse : approche microfluidique et analyse aux rayons X

par Niels Junius

Thèse de doctorat en Physique pour les sciences du vivant

Sous la direction de Monika Budayova-Spano.

Soutenue le 18-11-2016

à Grenoble Alpes , dans le cadre de École doctorale physique (Grenoble) , en partenariat avec Institut de biologie structurale (Grenoble) (laboratoire) .

Le président du jury était Wim Burmeister.

Le jury était composé de Stéphane Veesler, Jean-Baptiste Salmon, Jean-Luc Ferrer.

Les rapporteurs étaient Claude Sauter, Françoise Bonnete.


  • Résumé

    La cristallisation des protéines est une étape cruciale dans l’élucidation de la structure tridimensionnelle des protéines. C’est un processus très délicat qui dépend de nombreuses variables environnementales dont le contrôle précis est difficile, voire impossible, dans les installations typiquement utilisées. Des approches basées sur la parallélisation massive des expériences et la réduction du volume d’échantillon par expérience, pour trouver les conditions initiales de cristallisation, montrent leur relative efficacité dans la recherche de ces conditions initiales mais aussi leurs limites quant à l’optimisation des cristaux obtenus.La méthode présentée dans cette thèse diffère de ce paradigme. La démarche proposée est une approche séquentielle plutôt que la parallélisation d’expériences et est basée sur la connaissance des diagrammes de phase. Cette thèse repose sur une suite de développements d’instruments mis en oeuvre pour maîtriser et rationaliser la cristallisation par la méthode de la dialyse, permettant ainsi l’exploration des diagrammes de phases sans consommer l’échantillon de protéine.Il en résulte un dispositif microfluidique permettant la cristallisation de protéines par la méthode de la dialyse, l’utilisation d’un flux continu d’agent de cristallisation et par conséquent l’échange continu de conditions de cristallisation ainsi que le contrôle de la température au cours de l’expérience. Il est compatible avec le rayonnement X pour la collecte de données de diffraction in situ sur les cristaux ayant poussés dans la puce microfluidique. Ce système microfluidique est basé sur la miniaturisation du banc de cristallisation qui a été amélioré d’un point de vue : de l’électronique pour l’automatisation, du transport de fluides pour le fonctionnement en flux continu, du développement logiciel pour le contrôle des paramètres de cristallisation, de la mécanique pour améliorer la cellule de dialyse et la thermorégulation, et enfin par l’intégration d’un système UV permettant de réaliser des mesures d’absorbance in situ qui offre pour l’avenir la possibilité de mesurer la solubilité de protéine au cours d’une expérience de cristallisation par la dialyse.Finalement les développements instrumentaux et méthodologiques ont été validés par la cristallisation de plusieurs protéines modèles dont les cristaux ont diffractés aux rayons X avec succès. En outre le transport d’espèces en solution par la dialyse a été étudié par une approche combinée expérimentale et théorique.

  • Titre traduit

    Instrumental developments for controlling the crystallization by dialysis : microfluidic approach and X-ray analysis


  • Résumé

    Protein crystallization is a key step in elucidating three-dimensional structure of proteins. This very sensitive process depends on many variables that are difficult to control precisely or simultaneously in the existing facilities. Instrumentation developments have concentrated on massive parallel experiments and sample volume reduction used by experiment. With this approach it is relatively easy to find initial crystallization conditions but their optimization to yield well diffracting crystals often proves to be more difficult.The method presented herein differs from the current paradigm, since we propose serial instead of parallel experiments based on the knowledge of phase diagrams. This project is based on a series of developments of instruments used to control and rationalize crystallisation using dialysis method, thus allowing phase diagrams exploration without consuming large quantity of protein sample.This results in a microfluidic device that allows crystallization of proteins by dialysis method, use of a continuous flow of crystallization agent and therefore continuous exchange of crystallization conditions as well as temperature control during experiment. It provides X-rays compatibility for in situ diffraction data collection of crystals grown in the microfluidic chip. This microfluidic system is based on the miniaturization of the crystallization bench which has been improved on electronics for automation, fluid transport to operate at a continuous flow, software development for the control of crystallization parameters, mechanics to improve both dialysis cell and thermoregulation, and finally by the integration of a UV system to perform in situ absorbance measurements that provide the future possibility to measure the solubility of proteins in a dialysis crystallization experiment.Finally both instrumental and methodological developments have been validated by the crystallization of several model proteins whose crystals diffracted succesfully X-rays. Furthermore understanding of the transport of species in solution by dialysis was investigated by combined experimental and theoretical approaches.


Il est disponible au sein de la bibliothèque de l'établissement de soutenance.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Savoie Mont Blanc (Chambéry-Annecy). Service commun de la documentation et des bibliothèques universitaires. Bibliothèque électronique.
  • Bibliothèque : Service Interétablissement de Documentation. Documentation électronique.
  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation. STM. Documentation électronique.
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.