Fonctionnalisation, bio-conjugaison et études toxicologiques de quantum dots

par Lucia Mattera

Thèse de doctorat en Chimie Biologie

Sous la direction de Peter Reiss et de David Djurado.

Le président du jury était Frédérique Loiseau.

Le jury était composé de Loïc Charbonnière, Niko Hildebrandt.

Les rapporteurs étaient Michel De Waard, Thomas Pons.


  • Résumé

    La médecine moderne fait aujourd’hui face à de nombreux défis, comme le diagnostic précis et rapide des maladies. En raison de leurs propriétés photophysiques uniques, les quantum dots (QDs) sont des marqueurs fluorescents prometteurs pour la détection biologique. Le but principal de ce travail est le développement de conjuguées QD-anticorps (AB) en vue de leur utilisation dans des fluoroimmunoassays FRET (Förster Resonance Energy Transfer) pour la détection de la PSA (Antigène Spécifique de la Prostate), biomarqueur du cancer de la prostate. Dans ces systèmes, les QDs agissent comme accepteurs d’énergie en combinaison avec des complexes de terbium agissant comme donneurs. Grâce aux propriétés de luminescence spécifiques de ces deux classes de fluorophores, la mesure résolue en temps du signal de QDs permet la détection rapide et sensible des marqueurs biologiques. Nous avons développé une nouvelle approche en deux étapes pour la fonctionnalisation et la bioconjugaison de QDs qui donne des systèmes QD-AB fortement luminescents, stables et ultra compacts, maximisant ainsi l'efficacité de FRET. Dans une première étape, le transfert en phase aqueuse de QDs de phosphure d’indium (InP) synthétisés au laboratoire, émettant à 530 nm et de QDs commerciaux de CdSe émettant à 605 nm et 705 nm a été réalisé par échange de ligands de surface avec de la pénicillamine. Ensuite, la post-fonctionnalisation avec un ligand hétérobifonctionnel contenant un groupe acide lipoïque et une fonction maléimide permet le couplage ultérieur à des groupes sulfhydryle des protéines, a été effectuée. Après conjugaison des QDs avec des anticorps fragmentés (F(ab)) un très petit diamètre hydrodynamique (<13 nm) et une stabilité colloïdale à long terme (plusieurs années) ont été obtenus. L'applicabilité des sondes obtenues a été confirmée par la détection de PSA dans des échantillons de sérum, avec des limites de détection (LOD) très basses (0,8 ng/mL) pour les sondes émettant à 705 nm, dont l'absorption du spectre montre le plus grand recouvrement spectral avec l'émission du Tb. De plus, le greffage direct de complexes de terres rares sur la surface de QD a également été exploré, donnant accès à des sondes bimodales pour l'imagerie par resonance magnétique et par fluorescence (avec Gd) ou à des sondes biluminescentes (avec Eu, Yb). Dans ce dernier cas, la sensibilisation de la luminescence proche infrarouge de l’Yb par les QDs à base d’InP a été démontrée. Enfin nous avons réalisé des études de nanotoxicologie sur les différents types de QDs utilisés. En particulier, nous avons étudié la toxicité in vivo en utilisant l'organisme modèle Hydra vulgaris et la toxicité in vitro en utilisant des cellules de kératinocytes humains en comparant l’effet de systèmes cœur et cœur-coquille de QDs d’InP et de CdSe.

  • Titre traduit

    Functionalization, bio-conjugation and toxicity studies of quantum dots


  • Résumé

    One of the many challenges modern medicine is facing today is the accurate and early diagnosis of diseases. Due to their unique photophysical properties semiconductor quantum dots (QDs) are promising fluorescent labels for biosensing. The major aim of this work is the development of QD antibody (AB) conjugates to be used in Förster resonance energy transfer (FRET) immunoassays for the detection of the tumor biomarker PSA (prostate specific antigen). In these assays, the QDs act as FRET acceptors in combination with terbium complex donors. Thanks to the specific luminescence properties of these two classes of fluorophores, time-gated detection of the QD signal allows for the fast and sensitive detection of biomarkers. We developed a novel two-step approach for QD functionalization and bioconjugation which yields ultra compact, stable and highly luminescent QD-AB conjugates maximizing FRET efficiency. In the first step aqueous phase transfer of lab-synthesized InP-based QDs emitting at 530 nm and of commercial CdSe-based QDs emitting at 605 nm and 705nm was achieved by surface ligand exchange with penicillamine. Then, post-functionalization with a heterobifunctional crosslinker, containing a lipoic acid group and a maleimide function, enabled the subsequent coupling to sulfhydryl groups of proteins. This was demonstrated by QD conjugation with fragmented antibodies (F(ab)); the obtained conjugates have a very low hydrodynamic diameter < 13 nm and long-term colloidal stability. The applicability of the obtained probes was confirmed by the detection of PSA in serum samples with detection limits (LODs) down to 0.8 ng/mL for the 705 nm emitting probes, whose absorption spectrum shows the largest overlap integral with the Tb emission. In addition, direct grafting of rare earth complexes on the QD surface has also been explored, giving access to dual-mode imaging agents (with Gd) or to biluminescent (with Eu, Yb) probes. In the latter case, the sensitization of Yb NIR luminescence by InP-based QDs has been firstly demonstrated. Finally, we carried out nanotoxicological studies on the different types of QDs used. In particular we investigated in vivo toxicity using the model organism Hydra Vulgaris and in vitro toxicity using human keratinocyte cells comparing core and core/shell InP-based and CdSe-based QDs.


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