Approche thérapeutique ciblant la matrice extracellulaire et l'hypoxie en cancérologie. Preuve de concept dans le chondrosarcome

par Aurelien Voissiere

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la sante

Sous la direction de Elisabeth Miot et de Françoise Degoul.

Le président du jury était Françoise Redini.

Le jury était composé de Jean-Claude Monboisse, Sylvain Bohic, Bernadette Bouchon, Alain Le Pape, Caroline Peyrode.


  • Résumé

    Ce travail de thèse s’intègre dans la stratégie développée et brevetée par l’UMR 990 INSERM/UdA, qui consiste à exploiter l’affinité d’un vecteur ammonium quaternaire chargé positivement pour les protéoglycanes, afin d’acheminer des agents de diagnostic et/ou de thérapie, pour la prise en charge du chondrosarcome. Du fait de son abondante matrice extracellulaire de nature chondrogénique, de sa faible vascularisation et de son environnement hypoxique, le chondrosarcome est une tumeur chimio- et radio-résistante. Le seul traitement efficace à ce jour reste la chirurgie qui possède un taux de survie à 10 ans de seulement 21% en cas de rechute et dans les formes les plus graves. Dans ce contexte, une prodrogue cytotoxique activable en hypoxie dérivée du cyclophosphamide, de type nitroimidazole (8-QA) et possédant un ammonium quaternaire, a été développée et évaluée in vitro et in vivo, comparativement à son équivalent non « quaternisé » (8) et à un équivalent « quaternisé » mais non activable en hypoxie (10-QA). In vitro, les études par résonance plasmonique de surface (SPR) ont montré que les deux prodrogues « quaternisées », 8-QA et 10-QA possédaient une affinité plus importante pour l’agrécane que la prodrogue 8 ne possédant pas le vecteur ammonium quaternaire. Par la suite, nous avons développé un modèle de culture en 3 dimensions (sphéroïdes) des cellules de chondrosarcome humain HEMC-SS qui reproduit le microenvironnement hypoxique et riche en protéoglycanes retrouvé dans les tumeurs du cartilage in vivo. Les molécules activables en hypoxie 8-QA et 8 ont une activité cytotoxique supérieure en situation d’hypoxie qu’en normoxie, avec une résistance aux traitements augmentée pour le modèle de sphéroïde comparativement aux cellules cultivées en 2-D. In vivo, sur un modèle de xénogreffe de cellules de chondrosarcome humain HEMC-SS implantées sur des souris SCID, modèle préalablement caractérisé en terme d’hypoxie (imagerie photoacoustique, échographie de contraste, Doppler) et de protéoglycanes, la molécule 8-QA entraine (i) une inhibition significative de la croissance tumorale de 62,1%, alors que la molécule 8 et la molécule 10-QA n’ont aucune activité in vivo ; (ii) une diminution des effets indésirables, améliorant ainsi l’index thérapeutique. La caractérisation de l’activité antitumorale sur les tumeurs prélevées a mis en évidence une diminution de l’activité mitotique, une augmentation de l’apoptose (p53S15) et une diminution de la prolifération (PCNA) pour les échantillons traités avec la molécule 8-QA. De plus les études d’immunohistochimie ont montré que cette molécule entraine une augmentation des dommages à l’ADN (marquage γH2Ax) retrouvés majoritairement dans les régions hypoxiques (marquage au pimonidazole). La dernière partie de ce travail de thèse a consisté à optimiser, chez des souris NUDE, de nouveaux modèles in vivo de chondrosarcome humain exprimant à la fois un environnement hypoxique et une matrice extracellulaire riche en protéoglycanes pour affiner la caractérisation de l’activité anticancéreuse de la molécule 8-QA. Pour cela nous avons développé un modèle de xénogreffe de sphéroïdes HEMC-SS implantés en situation sous cutanée et un modèle orthotopique de cellules de chondrosarcome humain HEMC-SS implantées en position paratibiale. Après caractérisation, les premiers résultats d’efficacité antitumorale sur ces deux modèles ont confirmé une activité prometteuse de la molécule 8-QA. En conclusion, ces travaux de thèse auront permis de démontrer que l’exploitation des caractéristiques phénotypiques du chondrosarcome par une approche bi-spécifique est une stratégie prometteuse pour la prise en charge thérapeutique de cette pathologie, certes rare mais redoutable. Il a également contribué à montrer l’importance de l’interaction des cellules tumorales avec leur environnement pour la réponse aux traitements de chimiothérapie.

  • Titre traduit

    Therapeutic approach targeting extracellular matrix and hypoxia in oncology.


  • Résumé

    This work takes place in the strategy developed and patented by our lab UMR 990 INSERM/UdA, that exploits the affinity of positively charged quaternary ammonium to proteoglycans, in order to address diagnostic and/or therapeutic agents for chondrosarcoma management. Due to its abundant chondrogenic extracellular matrix, its poor vascularization and its hypoxic microenvironment, chondrosarcoma is chemo- and radio-resistant. The only effective treatment remains surgical resection that could be at the origin of a 10-years survival rate of 21% in case of local relapse of high-grade tumors. In this context, a quaternary ammonium-conjugated hypoxia-activable prodrug, 8-QA, has been developed and studied in vitro and in vivo respectively to its non-quaternary ammonium conjugated derivative, 8, and to a quaternary ammonium-conjugated non-hypoxia activable 10-QA. In vitro, surface plasmon resonance (SPR) studies evidenced that the two quaternary ammonium-conjugated derivatives, 8-QA and 10-QA, highlighted a higher affinity for aggrecan than non-quaternary ammonium conjugated prodrug 8. We have then developed a 3-D culture model (spheroid) of human chondrosarcoma HEMC-SS cell line that was demonstrated to reproduce the hypoxia and proteoglycan-rich microenvironment similar to in vivo cartilaginous neoplasms. Hypoxia-activated prodrugs, 8 and 8-QA, exhibited a higher cytotoxic activity in hypoxia as compared to normoxia, associated to an increased resistance for 3-D culture respectively to 2-D cells. In vivo, on human HEMC-SS xenograft model implanted on SCID mice and previously characterized in term of hypoxia (photoacoustic and contrast echographic imaging, Doppler), 8-QA derivative induced (i) a significant inhibition of tumor growth of 62,1% while 8 and 10- QA derivatives did not exhibit any antitumor activity; (ii) a decrease of side effects, both improving the therapeutic index. Mechanistic analysis on tumors sampled evidenced a decrease of mitotic activity and proliferation (PCNA), an increase of apoptosis (p53S15) for 8-QA treated tissues. Interestingly, immunohistochemistry studies highlighted that 8-QA caused DNA damages (evidenced by γH2Ax marker) which are mainly localized in hypoxic areas (pimonidazole staining). Finally, we optimized, on NUDE mice, new in vivo human chondrosarcoma models highly expressing simultaneously a hypoxic and proteoglycan-rich microenvironment in order to refine the characterization of 8-QA antitumor activity. For this, we developed a xenograft model of HEMC-SS spheroid implanted subcutaneously and an orthotopic model of HEMC- SS cells inoculated in paratibial location. After characterization, first results of antitumor efficacy on these two models confirmed the promising activity of 8-QA derivative. To conclude, this work demonstrates the proof of concept that exploiting the phenotypic features of chondrosarcoma by a bi-selective approach, is a promising innovative strategy for the therapeutic management of this pathology, relatively rare but redoubtable. This work also demonstrates the role of tumor cell interactions with their environment for tumor growth and response to chemotherapy treatments.

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