Dynamique de l'exoprotéome et homéostasie rédox chez Bacillus cereus : rôle de l'oxydation et réduction des résidus méthionines

par Jean-Paul Madeira

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Catherine Duport.

Soutenue le 23-06-2016

à Avignon , dans le cadre de École doctorale 536 « Sciences et agrosciences » (Avignon) , en partenariat avec Sécurité et Qualité des Produits d'Origine Végétale (laboratoire) .

Le président du jury était Jean Armengaud.

Le jury était composé de Béatrice Alpha.

Les rapporteurs étaient Pascal Cosette, Laurence Girbal.


  • Résumé

    Bacillus cereus est une bactérie aéro-anaérobie facultative à Gram positif ubiquiste pouvant s’adapter à de nombreux environnements et s’y développer. C’est un agent pathogène de l’homme capable de produire tout un éventail de protéines extracellulaires et de toxines jouant un rôle majeur dans la pathogénicité de ce micro-organisme. B. cereus croit suivant un métabolisme de type respiratoire en aérobiose et fermentaire en anaérobiose en l’absence d’accepteur final d’électrons. En aérobiose, la chaine respiratoire est une source majeure des dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) endogènes. En anaérobiose, les ROS endogènes sont générés en réponse au stress oxydant secondaire au stress nutritionnel et au stress réducteur, lorsque les cultures sont réalisées à bas potentiel d’oxydo-réduction (POR). Les résidus méthionines (Met) sont particulièrement sensibles à l’oxydation par les ROS. L’oxydation des Met conduit à la formation de méthionine sulfoxyde (Met(O)), un dérivé oxydé stable détectable par spectrométrie de masse (MS). L'oxydation des résidus Met est réversible : leur réduction est catalysée par des méthionines sulfoxyde réductases (Msr). Pour déterminer le rôle de l’oxydation des résidus Met, nous avons réalisé une étude exhaustive par MS de la dynamique de l’exoprotéome de la souche ATCC 14579 (pBClin 15) de B. cereus en aérobiose (pO2 = 100%) et en anaérobiose (pO2 = 0%) à haut (POR initial = +140 mV) et bas potentiel redox (PORi= -350 mV). Les résultats ont montré que la dynamique des toxines était représentative de la dynamique de l’exoprotéome à la fois en termes d’abondance relative de protéines et d’oxydation des Met dans les trois conditions testées. L’analyse des résultats suggèrent que (i) l’abondance des toxines et leur taux de méthionines oxydés reflètent le niveau d’oxydation cellulaire et (ii) la sécrétion de toxines au cours de la croissance cellulaire contribue au maintien de l'homéostasie redox intracellulaire en piégeant les ROS endogènes, en particulier en phase active de croissance en aérobiose et en fin de croissance en anaérobiose. Pour étayer l’hypothèse selon laquelle, les Met des protéines extracellulaires, et des toxines en particuliers sont des composants de la machinerie cellulaire antioxydante, nous avons construit une souche mutante ne synthétisant plus MsrAB et comparer le protéome et l’exoprotéome de cette souche mutante avec celle de la souche parentale en aérobiose et anaérobiose à haut POR. Cette étude a mis en évidence l’implication de MsrAB mais également du plasmide cryptique pBClin15 dans la sécrétion des toxines et le maintien de l'homéostasie redox intracellulaire

  • Titre traduit

    TIme dynamics and redox homestatis in Bacillus cereus : role of the oxidation and reduction of the methionine residues


  • Résumé

    Bacillus cereus is a Gram-positive aerobic or facultative anaerobic worldwide-distributed bacterium. In addition, B. cereus is a human pathogen able to produce a range of extracellular enzymes and toxins playing a major role in the virulence of the bacteria. In presence of oxygen, B. cereus performs respiration. Without oxygen or other electron acceptors, it performs mixed-acid fermentation. Under aerobiosis, the respiratory electron transport chain is a major source of endogenous reactive oxygen species (ROS). Under anaerobiosis, endogenous ROS are generated in response to reductive stress (mainly under high-reductive anaerobiosis) and to starvation (nutrient stress), i.e. in response to secondary oxidative stresses. Methionine residues (Met) of proteins are vulnerable to oxidation by free radicals. Oxidation of Met leads to the formation of methionine sulfoxide (Met (O)), a stable by-product detectable by mass spectrometry (MS). Met(O) can be reduced back to Met by the action of methionine sulfoxide reductase (Msr). To determine the role of oxidation of Met residues, B. cereus exoproteome time courses were monitored by MS under low oxidation-reduction potential (ORP) anaerobiosis (initial ORP = +140 mV and pO2 = 0%), high-ORP anaerobiosis (iORP = -350 mV and pO2 = 0%), and aerobiosis (pO2 = 100%). The results indicated that toxin-related proteins were the most representative of the exoproteome changes, both in terms of protein abundance and their Met(O) content in the presence and in the absence of oxygen. The analysis results suggest that (i) the abundance of toxins and their oxidized methionines rates reflect the cellular oxidation level and (ii) the secretion of toxins during growth helps to maintain redox homeostasis by keeping endogenous ROS at bay, during the exponential growth phase under aerobic conditions and at the end of growth under anaerobiosis. To support our hypothesis that Met residues of extracellular proteins, particulars of toxins are components of the cellular machinery antioxidant, we constructed a mutant strain by deleting the gene of MsrAB and compare the cellular proteome and exoproteome of this mutant strain with the wild-type strain under aerobiosis and high-ORP anaerobiosis. This study highlighted the involvement of MsrAB but also pBClin15 plasmid in the secretion of toxins and maintain of the intracellular redox homeostasis.



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