Etude in vivo et in vitro du rôle biologique des interactions de CXCL 12 et CXCL 13 avec les protéoglycanes

par Lingjie Luo

Thèse de doctorat en Immunologie

Sous la direction de Fernando Arenzana-Seisdedos.

Soutenue en 2015

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris) , en partenariat avec Université Paris Diderot - Paris 7 (autre partenaire) .


  • Résumé

    Pour accomplir leurs fonctions essentielles, les chimiokines activent des récepteurs couples aux protéines G heterotrimeriques exprimés à la surface des leucocytes. Au-delà de cette interaction fondamentale avec leurs récepteurs, les chimiokines se lient de manière non covalente aux moities glycaniques (glycosaminoglycanes, gags) des protéoglycanes. De l'affinité des interactions avec les gags dépendent leur immobilisation tissulaire et la formation de gradients qui gouvernent les mécanismes de chimiotaxie et d'haptotaxie. L'intégrité de ces mécanismes pourrait être essentielle pour que les chimiokines puissent accomplir pleinement leurs fonctions biologiques, aussi bien en homéostasie que dans des situations physiopathologiques. Mon travail de thèse de doctorat s'inscrit dans une recherche pionnière initiée par mon laboratoire d'accueil. Il est axe sur l'étude du rôle in vivo des interactions des chimiokines CXCL12, chimiokine essentielle, et CXCL13 dans la régulation des réponses immunitaires, en particulier de la réponse humorale, dans laquelle CXCL13 et CXCL12 coopèrent positivement à son homéostasie. Les objectifs spécifiques du travail sont : i) la recherche du fonctionnement des centres germinatifs (CGS) des organes lymphoïdes secondaires chez des animaux portant une invalidation sélective de la fonction d'interaction des isoformes de CXCL12 avec les gags. Ii) l'identification et la caractérisation biochimique et fonctionnelle des déterminants moléculaires de CXCL13 complétée par une analyse structurelle de la protéine. Les données de mon travail montrent que chez les animaux mutants CXCL12gagtm/ gagtm il existe une très forte proportion de cgs configures de manière anormale, ou les compartiments DZ et LZ du CG ne sont pas bien délimités. Chez les animaux mutants, des cellules lz de grande taille sont fréquemment observees et expriment des marqueurs témoignant d'une activité mitotique. Ces cellules pourraient correspondre à des cellules du compartiment dz (centroblastes) ectopiquement localisées dans LZ comme conséquence de la disruption du gradient de CXCL12. Chez les animaux mutants on observe une diminution des mutations somatiques dans les gènes des immunoglobulines des cellules des cgs et post-cgs, qui s'accompagne de la diminution des anticorps de haute affinité produits en réponse à l'immunogène np. Nous concluons que les anomalies structurelles et fonctionnelles (cause et conséquence) dérivent de l'absence d'immobilisation de CXCL12. Chez l'animal mute, lorsque CXCL12 n'est pas fdœee à des surfaces cellulaires ou extracellulaires, la migration et localisation aberrante des cellules dz entraine un disfonctionnement de la production et la sélection des cellules b productrices des anticorps de haute affinité. L'abolition de l'interaction de CXCL12 avec les gags dans le cg serait ainsi à l'origine de la réponse immunitaire humorale sous-optimale observée chez les animaux CXCL12 gagtm/gagtm. Nous avons systématiquement effectue une mutagenèse CXCL13 murin et identifie d'abord les mutants qui conservaient une expression intacte dans les cellules eucaryotes. Puis, nous avons procédé a l'analyse fonctionnelle de chaque mutant avec, en parallèle, une évaluation de leurs interactions avec des gags immobilises soit in vitro (surface plasmonic résonance), soit in cellulo, à l'aide des cellules qui diffèrent génétiquement par leur expression des gags. Nos résultats montrent que deux déterminants moléculaires de CXCL13 coopèrent positivement dans la liaison sélective aux gags de type heparan sulphates (HSS). En outre, les mutants ainsi génères ont des expressions et des fonctions de Signalisation préservées via cxcr5. L'analyse structurale de la protéine CXCL13 montre aussi que les mutations dans les déterminants impliques dans la liaison aux HSS, n'affectent pas la structure générale de la chimiokine. Dans leur ensemble, ces résultats prouvent que l'invalidation par mutagenèse des Interactions du CXCL13 murin avec les hss est compatible avec une préservation de son expression et de ses fonctions biologiques. Ceci est une condition sine qua non pour développer une souris modifiée génétiquement permettant d'analyser sans biais le rôle in vivo de l'immobilisation de CXCL13 sur les protéoglycanes. La combinaison de deux mutations sur les deux gènes CXCL12 et CXCL13 devrait permettre la génération d'animaux viables. S'agissant des mutations affectant sélectivement l'interaction avec les protéoglycanes, sans diminution des pouvoirs agonistes de deux chimiokines, le modèle devrait permettre l'élucidation sans biais du rôle de l'immobilisation tissulaire de CXCL12 et CXCL13 sur leurs fonctions biologiques.

  • Titre traduit

    In vivo and in vitro biological roles of CXCL12 and CXCL13 interactions with proteoglycans


  • Résumé

    To fulfill their core functions, chemokines activate receptors coupled to heterotrimeric g proteins expressed on the surface of leukocytes. Beyond this fundamental interaction with their receptors, chemokines also bind non-covalently to the glycan moieties (glycosaminoglycans, gags) of proteoglycans. Gags dependent tissue immobilization and formation of chemokine gradients that govern chemotaxis and haptotactic mechanisms largely relies in the affinity of gag/chemokine interactions. The integrity of these mechanisms might be essential for chemokines to fully perform their biological functions in homeostasis as well as in pathophysiological situations. My phd studies pursue a pioneer research initiated by my host laboratory. It focuses on the study of the role played in vivo by the interactions of the chemokines CXCL12, the only essential chemokine, and CXCL13 in the regulation of immune responses, and in particular, of the anamnestic b cell response wherein CXCL13 and CXCL12 positively cooperate to maintain the homeostasis of humoral immunity. Specific objectives of this work are: i) to study the structure and function of secondary lymphoid organs, and in particular of germinal centers (gc), in an animal model carrying a selective genetic invalidation of CXCL12/gags interactions; ii) to assess the capacity of CXCL13 to interact with gags and eventually to identify the molecular determinants accounting for and characterize the structure/function relationships of CXCL13/gags interactions. Our findingsshow that in the mutant animals CXCL12gagtm / gagtm there is a very high proportion of abnormally configured gcs, where dark zone (dz) and light zone (lz) compartment of the gc are not well defined. In mutant animals, large lz cells are commonly seen and express markers indicating mitotic activity. These cells might would correspond to centroblasts, that typically localizes in the dz compartment, ectopically settled in the lz as a consequence of the disruption of CXCL12 gradient. In mutant animals, a decrease is observed in the number of somatic mutations in gc- and post-gc-cell immunoglobulin genes, together with the reduction of high-affinity antibodies produced in response to the immunogen np. We conclude that the structural and functional abnormalities (cause and effect) derive from the absence of immobilization of CXCL12 in the dz compartment where this chemokines has been shown to accumulate preferentially in the gc structure. Mutant animals show aberrant migration and localization of dz cells which causes a dysfunction of both the production and selection of b cells expressing high affinity antibodies. The abolition of the interaction of CXCL12 with gags in the gc causes a Suboptimal humoral immune response in CXCL12gagtm/gagtmanimals. We have systematically performed a murine CXCL13 mutagenesis and first identified mutants that retained an intact expression in eukaryotic cells. Then we conducted functional analysis of each mutant together with an assessment of their interactions with immobilized gags either in vitro (surface plasmonic resonance) or in cellulo, using cells that differ genetically by their expression of gags. Our results show that two molecular determinants of CXCL13 positively cooperate to enable a selective, high-binding affinity of the chemokine to gags type heparan sulphates (hs). Furthermore, the mutant chemokines disabled of hs-binding capacity, exhibited a fully preserved, as compared to the wild type counterpart, cell-signaling functions via cxcr5. Structural analysis of the CXCL13 protein shows that mutations in the determinants involved in binding to hs do not affect the overall structure of the chemokine. Taken together, these results prove that the invalidation by mutagenesis of murine CXCL13 interactions with hs is compatible with the preservation of both expression and biological functions. This is a mandatory prerequisite for developing a genetically modified mouse, which would enable the study of the role played in vivo by the immobilization of CXCL13 on cell/tissue proteoglycans and makes conceivable the generation of viable animals encoding CXCL12 and CXCL13 genes. An animal model encompassing mutated CXCL12 and CXCL13 genes selectively disabled to complex with gags but expressing chemokines with intact agonist properties, would be an invaluable tool to perform an unbiased and complete study of the contribution of proteoglycan-anchoring to the biological roles of these important chemokines.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (154 p.)
  • Annexes : 313 réf.

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  • Cote : TS (2015) 186
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