La microscopie électrochimique à force atomique à médiateur lié pour sonder in situ l'organisation spatiale de nano-objets biologiques fonctionnels : De la particule virale à la macromolécule individuelle

par Cécilia Taofifenua

Thèse de doctorat en Electrochimie moléculaire et biologique

Sous la direction de Christophe Demaille.


  • Résumé

    Ce travail de thèse a été consacré à l'application de la microscopie AFM-SECM à médiateur lié, (Mt/AFM¬SECM) à deux domaines apparemment distincts mais ayant en commun la nécessité de développer des approches expérimentales nouvelles permettant des mesures inédites à une échelle nanométrique. Au premier chapitre, la capacité de la microscopie Mt/AFM-SECM à sonder simultanément les forces locales et la dynamique conformationelle de macromolécules redox immobilisées a été mise à profit pour la caractérisation d'un système constitué de chaînes poly(ethylene glycol) (PEG) portant une tête redox ferrocene (Fc) et un pied d'ancrage pyrene assemblées sur surface d'HOPG. En utilisant une approche électrochimique multi-échelle, nous avons montré que les chaines Fc-PEG-Pyrene s'auto-assemblent aisément sur le HOPG pour former une couche extrêmement homogène. Cependant, le caractère adsorbant et fortement hydrophobe des plans graphitiques mène à une structure complexe de la couche qui dépend de la couverture des chaines PEG en raison de l'interaction entre la tête ferrocene et la surface d'HOPG. Les résultats obtenus ici sont sans nul doute généralisables au cas de chaines PEG ancrées sur toute surface graphitique (nanotube de carbone, graphène) via un pied pyrène et portant à leur extrémité libre un groupement redox, fluorescent ou liant présentant un certain degré, même faible, d'hydrophobicité. Le second chapitre de ce travail a été consacré à l'étude par Mt/AFM-SECM d'un système nano-biologique totalement original : des virus de plantes (LMV, PVA) portant des chaines redox Fc-PEG positionnées à des emplacements prédéfmis le long des particules virales grâce à des anticorps spécifiques. Nous avons démontré que la microscopie Mt/AFM-SECM permettait de localiser les virus immobilisés sur surface d'or, d'imager leur topographie et d'échantillonner ainsi leur disparité topologique, mais aussi d'interroger spécifiquement les fonctions redox qu'ils portent. La distribution statistique de ces fonctions d'un virus à l'autre, mais aussi leur répartition le long des particules virales individuelles, a ainsi pu être étudiée. Ce résultat fait de la Mt/AFM-SECM un outil de caractérisation fonctionnelle unique pour la nanotechnologie virale. Concomitamment nous avons démontré que la microscopie Mt/AFM-SECM à anticorps redox constitue une nouvelle technique d'immuno-imagerie in situ capable de localiser spécifiquement des protéines exposées à la surface de virus. En réussissant à imager la protéine virale VPg, présente en un seul exemplaire à l'extrémité du virus LMV, nous avons fait la démonstration de la résolution macromoléculaire de cette microscopie combinée, une première pour une microscopie dérivée de la SECM.


  • Résumé

    This work has been devoted to the application of mediator-tethered (Mt) AFM-SECM microscopy to two different scientific issues sharing a common need for new experimental approaches enabling nano-scale investigations. In the first chapter the ability of Mt/AFM-SECM to simultaneously probe local forces and conformational dynamics of immobilized redox macromolecules has been used for characterizing the behavior of polyethylene glycol (PEG) chains bearing a redox ferrocene (Fc) head and an anchoring pyrene foot, assembled onto a HOPG surface. We have shown, following a multiscale electrochemical approach, that Fc-PEG-Pyrene chains readily self-assemble onto HOPG to form extremely homogeneous layers. However the strongly hydrophobie adsorbing nature of graphite planes results in a complex coverage-dependent structure of the PEG layer due to the interaction of the ferrocene label and the HOPG surface. The results we obtained are likely to be transposable to the case"of PEG chains attached to any HOPG¬like surface (carbon nanotube, graphene) via a pyrene ring and end-functionalized by a redox, a fluorescent or a binding probe (e. G. Biotin), all typically displaying some degree of hydrophobicity. In the second chapter of the present work, Mt/AFM-SECM has been used for characterizing an original, genuinely nanometer-sized biological system: plant viruses (LMV,PVA) bearing redox Fc-PEG chains spatially organized on the virus shell through the use of redox labeled antibodies. Acquisition of topography images allowed isolated virus particles to be identified, and structurally characterized, while simultaneous acquisition of current images allowed the redox function of the modified viruses to be probed. As a result, we could reveal the way redox-functionalization was distributed both statistically among the viruses but also spatially over individual viruses. This possibility potentially makes Mt/AFM-SECM a versatile tool in the field of viral nanotechnology. Concomitantly, we demonstrated that immunoredox Mt/AFM-SECM imaging enables the in situ mapping of the distribution of specific proteins on individual virus particles down to the single protein scale. Achieving such a biomolecular resolution is a first for a SECM- based technique.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (155 p.)
  • Annexes : 186 réf. Annexes

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  • Cote : TS (2015) 130
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