Approches protéomiques pour l’analyse des exosomes de liquides biologiques pour la recherche de biomarqueurs

par Matthieu Bourderioux

Thèse de doctorat en Physiopathologie

Sous la direction de Aleksander Edelman.

Soutenue le 05-10-2015

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris) , en partenariat avec Université Paris Descartes (établissement de préparation) et de Institut Necker Enfants-Malades (laboratoire) .


  • Résumé

    Un biomarqueur est une molécule (ou un ensemble de molécules) présente dans l’organisme qui témoigne de l’apparition d’un processus pathologique. Il permet ainsi de dépister une maladie, d’en prédire sa gravité ou encore d’évaluer l’efficacité d’un traitement. Les liquides biologiques représentent des milieux de choix pour la recherche de biomarqueurs en pathologie humaine car leur collection est habituelle dans la prise en charge des patients et moins invasive comparée aux biopsies d’organes ou de tissus. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux exosomes présents dans ces liquides biologiques. Les exosomes sont des nanovésicules dont le diamètre est compris entre 30 et 100 nanomètres. Ils sont sécrétés par tous les types cellulaires et contiennent des protéines cytoplasmiques et membranaires spécifiques de leur cellule d’origine. L’intérêt majeur des exosomes isolés à partir des liquides biologiques, est qu’ils constituent une source de biomarqueurs. Ils peuvent donc être assimilés à une « biopsie liquide ». L’analyse des exosomes pourrait compléter utilement des examens classiques de dépistage, de diagnostic et de suivi d’une pathologie. Dans le cadre de projet de cette thèse, nous avons appliqué des techniques de protéomique à haut débit pour l’analyse des exosomes. Nous nous sommes tout d’abord intéressés à l’analyse du profil protéique des exosomes urinaires dans le contexte de deux pathologies du tractus urinaire : la cystinurie et le cancer du rein. La cystinurie est une néphropathie lithiasique d’origine génétique pour laquelle il y a peu de marqueurs biologiques pouvant prédire son évolution vers l’insuffisance rénale terminale. Nous avons développé une méthode de préparation des exosomes urinaire permettant d’analyser de façon reproductible leurs profils protéiques. Nous avons appliqué cette méthode à huit patients cystinuriques et comparé les résultats aux profils obtenus chez dix sujets sains. Un panel de 38 protéines différentiellement exprimé dans les exosomes des patients a été identifié et en partie validé par Western blot. Concernant le cancer du rein à cellules claires pour lequel le diagnostic nécessite des prélèvements invasifs par biopsie, nous avons analysé les exosomes urinaires de huit patients avant et après néphrectomie. Nous avons ainsi pu mettre en évidence un panel de 25 protéines surexprimées dans les exosomes des patients. Enfin, le dernier volet de cette thèse a été consacré à l’analyse des exosomes du lavage broncho-alvéolaire provenant de patients MV, maladie d’origine génétique qui atteint principalement les poumons. L’analyse des exosomes de lavage broncho-alvéolaire pourrait permettre de donner un éclairage nouveau sur la physiopathologie de la maladie. Nous avons réalisé la comparaison des profils protéiques des exosomes de quatre patients MV, et six patients asthmatiques. L’ensemble des résultats obtenus au cours de cette thèse montre que l’analyse protéomique des exosomes issus de fluides biologiques peut aider la recherche de biomarqueurs diagnostics ou pronostics de maladies.

  • Titre traduit

    Proteomic approaches for biological fluids exosomes analysis for biomarker discovery


  • Résumé

    A biomarker is a molecule (or a cluster of molecule) which will reflect the occurrence of a pathological state, giving us the ability to detect a disease, to predict its severity or to assess drug efficiency. Biological fluids are the golden standards for biomarker research in human as they are routinely collected for patients’ follow-up and are less invasive than biopsies. During my PhD, I focused on exosomes that can be found in these biological fluids. Exosomes are nanovesicles with a diameter ranging between 30 and 100 nanometers. Exosomes are secreted by all cell types and harbor cytoplasmic and membranous proteins specific of their cells of origins. One of the major interest of exosomes enriched from biological fluids is that they represent a valuable source of biomarkers. They can be considered as a « liquid biopsy ». Their analysis could complete classical diagnosis and follow-up tools. In this project, we applied high resolution, high throughput proteomic techniques for exosomes analysis. We firstly focused on protein profiles in urinary exosomes in the context of two urinary tract diseases: cystinuria and kidney cancer. Cystinuria is an inherited autosomal recessive disease that is characterized by the formation of cystine stones in the kidneys. To date, there are no markers to predict the evolution toward end stage renal disease. We developed a method to prepare exosomes in order to reproducibly analyze their protein profiles. We applied this method to eight cystinuria patients and compared their profiles to those of ten healthy subjects. A panel of 38 differentially expressed proteins in patients were found and validated by western blots. We also applied this method to patients with clear cell renal cell carcinoma, for which invasive biopsies are necessary for clear diagnosis. We analyzed urinary exosomes form eight patients before and after nephrectomy. We were able to highlight 25 overexpressed proteins in patients’ exosomes. Eventually, the last part of my thesis was dedicated to the analysis of exosomes enriched from bronchoalveolar lavage fluid collected in cystic fibrosis patients, a disease that affects mostly the lungs. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes analysis could give a new insight on the mechanisms of this disease. We compared protein profiles in exosomes from four cystic fibrosis patients and six asthmatic patients. The whole point of this work is to show that proteomic analysis of exosomes isolated from biological fluids could become a golden standard for the discovery of diagnosis or prognosis biomarkers.


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