Contribution à l'étude des mécanismes moléculaires de chimiorésistance des cellules cancéreuses pancréatiques

Study of molecular mechanisms involved in pancreatic cancer cell chemoresistance

• Auteur / Autrice : Marion Gayral
• Direction : Pierre Cordelier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies, cancérologie
• Date : Soutenance le 29/06/2015
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (2011-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytidine

Résistance aux médicaments

Pancréas

Mots clés libres

Pancréas

Cancer

Chimiorésistance

Cytidine désaminase

Virus oncolytiques

Thérapie génique

Pancreas

Cancer

Chemoresistance

Cytidine desaminase

Oncolytic viruses

Gene therapy

Résumé

Le cancer du pancréas (CP) est la quatrième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux avec un taux de survie à cinq ans inférieur à 5 %. Son incidence est en augmentation depuis les quarante dernières années ; en l'absence d'amélioration dans le dépistage et le traitement, le CP deviendra la deuxième cause de décès par cancer dans le monde d'ici 2020. Dans ce contexte sombre, nous avons récemment mené le premier essai clinique de thérapie génique pour les formes avancées de ce cancer durant lequel les patients ont reçu une injection intra-tumorale sous écho endoscopie d'un vecteur non viral codant pour le gène de fusion DCK:UMK et le gène SSTR2 combiné au traitement par chimiothérapie. Outre la faisabilité et la sécurité de ce protocole, la thérapie génique se traduit par un bénéfice clinique chez certains patients. Nous avons également mis en évidence deux éléments majeurs: cet effet bénéfique (1) n'est pas corrélé à la dose administrée (2) atteint un "plateau thérapeutique" au-delà duquel les cellules cancéreuses résistent au traitement, suggérant ainsi que le transfert de gène intra-tumoral est limitant et que des mécanismes additionnels de chimiorésistance restent à identifier et à cibler pour proposer de nouvelles stratégies plus efficaces. Ainsi, nous avons recherché les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la primo résistance des cellules cancéreuses au traitement par gemcitabine. Dans ce contexte, nous avons ainsi mis en évidence l'importance de la cytidine désaminase (CDA) qui catalyse la désamination hydrolytique irréversible des CTP en UTP. La CDA est surexprimée dans de nombreux cas de patients ne répondant pas à la chimiothérapie et dans les tumeurs pancréatiques par rapport au tissu sain adjacent. Dans des modèles expérimentaux, l'invalidation de la CDA se traduit par une profonde inhibition de la prolifération cellulaire et par l'induction massive d'apoptose, et cela, même en absence de gemcitabine. Une approche protéomique non biaisée nous a permis d'identifier une signature mitochondriale traduisant une reprogrammation métabolique en réponse au ciblage de cette enzyme. Enfin, combiner l'invalidation de la CDA et le traitement par gemcitabine se traduit par une diminution rarement égalée de la prolifération cancéreuse et de la progression tumorale in vivo. Nous avons ensuite recherché de nouveaux vecteurs plus efficaces pour la thérapie génique du cancer du pancréas. Nous avons étudié les virus oncolytiques dérivés d'HSV-1 dans les quels la ribonucléotide réductase virale est mutée, et dont l'expression de la protéine virale gamma 34.5 est sous le contrôle du promoteur du proto-oncogène B-myb (Myb34.5). Nous avons identifié un contexte moléculaire particulièrement favorable à la réplication de ce virus Myb34.5 dans les cellules cancéreuses pancréatiques humaines qui sur-expriment non seulement B-myb, mais aussi les ribonucléotide réductases cellulaires RRM1 et RRM2 alors que l'expression d'ENT1 est diminuée. Dans les lignées cancéreuses, Myb34.5 réplique à fort taux et inhibe de façon drastique la prolifération cellulaire, et induit la mort cellulaire par apoptose. Cet effet est majoré par le co-traitement des cultures par la gemcitabine. Enfin, le virus Myb34.5 en combinaison avec la gemcitabine, provoque la régression de tumeurs expérimentales. Durant ce travail de thèse, nous avons identifié de nouvelles cibles thérapeutiques pour combattre la chimiorésistance des cellules cancéreuses pancréatiques et démontré l'efficacité de virus oncolytiques dérivés d'HSV-1 pour le traitement de tumeurs pancréatiques expérimentales. A terme, ces travaux serviront de base à de nouvelles combinaisons de gènes thérapeutiques, délivrés ou non par des virus oncolytiques, afin de lever le "plateau thérapeutique" observé dans l'essai Thergap et ainsi d'éradiquer efficacement et spécifiquement les cellules tumorales pancréatiques.

Pancreatic cancer (PC) is the fourth leading cause of death by cancer in Western countries with a survival rate of less than 5% at five years. Its incidence has been increasing for the last forty years, and, in the absence of improvement in the detection and treatment, PC will become the second leading cause of death by cancer worldwide in 2020. Accordingly, we recently conducted the first gene therapy clinical trial for patients diagnosed with advanced PC, during which patients received using endoscopic ultrasound an intratumoral injection of a non viral vector encoding DCK::UMK and SSTR2 genes. Patients were also treated by gemcitabine. In addition to the feasibility and safety of this protocol, gene therapy results in a clinical benefit in selected patients. We also highlighted two major elements: this beneficial effect (1) is not correlated with the dose administered and (2) reaches a "therapeutic plateau" beyond which the cancer cells are resistant to treatment. These considerations suggest that the intratumoral gene transfer is limiting and that additional mechanisms of drug resistance remain to be identified and defeated to offer new therapeutic perspectives. Therefore, we first investigated the molecular mechanisms that may be involved in the primo resistance of cancer cells to gemcitabine. We highlighted the importance of cytidine deaminase (CDA) in cohort of patients that poorly responded to gemcitabine treatment. This enzyme, which catalyzes the irreversible hydrolytic deamination of CTP in UTP, is also overexpressed in PC as compared to adjacent tissue. In experimental models, the invalidation of CDA results in the profound inhibition of cell proliferation and massive induction of apoptosis, even in the absence of gemcitabine. Using an unbiased proteomic approach, we found that several proteins involved in mitochondrial metabolism are strongly altered in response to CDA targeting. Finally, combining the invalidation of the CDA and gemcitabine treatment results in a rarely achieved inhibition of cancer cell proliferation and tumor progression in vivo. We next investigated new delivery vectors/virus for the gene therapy of pancreatic cancer. We selected oncolytic viruses derived from HSV-1, in which the viral ribonucleotide reductase is mutated, and the expression of the viral protein gamma 34.5 is under the control of the proto-oncogene B-myb promoter (Myb34.5). We first identified a highly favorable molecular context for the replication of Myb34.5 in human pancreatic cancer cells as they over-express not only B-myb, but also cellular ribonucleotide reductase RRM1 and RRM2 whereas expression of ENT1 is decreased. In cancer cell lines, Myb34.5 replicates athigh rate, strongly inhibits cell proliferation and provokes cancer cell death by apoptosis. This effect is increased by the co-treatment with gemcitabine. Finally, Myb34.5 causes the regression of experimental tumors, when combined with gemcitabine. This thesis work opens several interesting prospects: we have identified new therapeutic targets to alleviate the chemoresistance of PC cells and demonstrated the efficacy of oncolytic viruses derived from HSV-1 for the treatment of experimental pancreatic tumors. Ultimately, this work may stem for new combinations of therapeutic genes, delivered or not by oncolytic viruses, to defeat the "therapeutic plateau" observed in PC experimental models and during the Thergap clinical trial and to specifically eradicate pancreatic tumor cells with high efficacy.