Biochemical characterization of the plastid terminal oxidase and its implication in photosynthesis

par Kathleen Feilke

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Anja Krieger-Liszkay.

Soutenue le 23-10-2015

à l'Université Paris-Saclay (ComUE) , dans le cadre de École doctorale Sciences du Végétal : du gène à l'écosystème (Orsay, Essonne ; 2015-....) , en partenariat avec Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....) (laboratoire) , Université Paris-Sud (1970-2019) (établissement opérateur d'inscription) et de Mécanismes régulateurs chez les organismes photosynthétiques (laboratoire) .

Le président du jury était Graham Noctor.

Le jury était composé de Anja Krieger-Liszkay, Graham Noctor, Marcel Kuntz.

Les rapporteurs étaient Fabrice Rappaport, Peter Nixon.

  • Titre traduit

    Caractérisation biochimique de l'oxydase terminale plastidiale et son implication dans la photosynthèse


  • Résumé

    L'oxydase terminale plastidiale (PTOX) est présente uniquement chez les organismesphotosynthétiques. PTOX oxyde le plastoquinol (PQH2) et réduit l'oxygène en eau.PTOX est impliquée dans la synthèse des caroténoïdes, dans le transportphotosynthétique d'électrons et dans la chlororespiration. De plus, son activité estconsidérée comme pouvant jouer un rôle en tant que soupape de sécurité, permettant de maintenir oxydé le pool de plastoquinones (PQ) et d'éviter la surréduction duchloroplaste et ainsi la photoinhibition. Chez la majorité des plantes testées, les niveaux de PTOX sont plus élevés dans des conditions de stress (une exposition à forte intensité lumineuse, par exemple). D'autre part, la surexpression de PTOX chez Arabidopsis thaliana n'a pas rendu les plantes moins sensibles à la photoinhibition. Par ailleurs, il semble que PTOX surexprimée chez Nicotiana tabacum a induit la génération des espèces réactives de l'oxygène (ERO) et une photoinhibition importante sous forte lumière.Le but de cette thèse était la caractérisation de l'activité enzymatique de PTOX enutilisant la protéine purifiée et de comprendre pourquoi PTOX protège du stressphotooxydant dans certaines conditions et pourquoi elle augmente ce stress quand elle est surexprimée in planta.L'analyse biochimique de PTOX recombinante purifiée a démontré que l'enzymeexiste principalement sous forme tétramérique. Cette forme se dissocie partiellement,principalement en dimères. Le turnover maximal de l'enzyme purifié correspond à 320électrons par seconde et par molécule de PTOX. Nous avons démontré que PTOXgénère des ERO dans une réaction secondaire dépendante de la concentration dusubstrat (PQH2) et du pH de la solution. À pH 8 (représentant le pH du stroma deschloroplastes actifs), PTOX a une activité antioxydante quand la concentration de PQH2 est basse et prooxydante quand cette concentration est élevée.En mesurant la fluorescence de la chlorophylle a, nous avons démontré quePTOX est active lorsqu'elle est ajoutée aux membranes enrichies en PSII.L'attachement aux membranes dépend du pH et de cations de la solution: lorsque le pHdiminue ou lorsque la solution est riche en cations monovalents, la quantité de PTOXattachée à la membrane diminue.L'activité de PTOX in planta et son effet sur le transport des électronsphotosynthétiques ont été analysés en utilisant Arabidopsis thaliana surexprimant laphytoène désaturase bactérienne (CRTI) et Nicotiana tabacum surexprimant PTOX1 deChlamydomonas reinhardtii. Arabidopsis thaliana surexprimant CRTI a un niveau plusimportant de PTOX et de production d'ERO et le transport cyclique des électrons estsupprimé chez les transformants. Cela implique que PTOX est en compétition avec letransfert cyclique pour les électrons du pool PQ et que PTOX joue un rôle importantdans le contrôle de l'état rédox de ce pool. En utilisant Nicotiana tabacum surexprimant PTOX1, nous avons démontré que PTOX fait concurrence au transfert linéaire d'électrons photosynthétique, mais que PTOX est inactivée quand le pH du stroma est neutre. Grâce aux résultats obtenus, nous proposons un modèle où l'association de PTOX avec la membrane est contrôlée par le pH du stroma. Quand le pH est neutre, PTOX est soluble et n'est pas active, ce qui évite l'interférence avec le transfert linéaire d'électrons. Quand le pH du stroma est alcalin et la chaîne des transporteurs photosynthétiques est surréduite (lors des conditions du stress), PTOX s'attache à la membrane, devient active et joue le rôle de soupape de sécurité.


  • Résumé

    The plastid terminal oxidase PTOX is encoded by higher plants, algae and some cyanobacteria. PTOX is a plastid-localized plastoquinol (PQH2) oxygen oxidoreductase. PTOX was shown to be implicated in plant carotenoid biosynthesis, photosynthetic electron transport and chlororespiration and may act as a safety valve protecting plants against photo-oxidative stress. PTOX protein levels increase during abiotic stress indicating a function in stress acclimation. But overexpression of PTOX in Arabidopsis did not attenuate the severity of photoinhibition or, when overexpressed in tobacco, even increased the production of reactive oxygen species (ROS) and exacerbated photoinhibition.Biochemical analysis of recombinant purified PTOX (PTOX from rice fused to the maltose-binding protein) showed that the enzyme exists mainly as a tetramer, which dissociated to a certain extent during electrophoresis, mainly into a dimeric form. The PTOX activity was 320 electrons s−1 PTOX−1. It was also shown that PTOX generates ROS in a side reaction in a substrate (decylPQH2) and pH-dependent manner when liposomes were used: at the basic stromal pH of photosynthetically active chloroplasts, PTOX was antioxidant at low decylPQH2 gaining prooxidant properties with increasing quinol concentrations. It is concluded that PTOX can act as a safety valve when the steady state [PQH2] is low while a certain amount of ROS is formed at high light intensities.It was shown by chlorophyll a fluorescence that recombinant purified PTOX is active when added to photosystem II (PSII)-enriched membrane fragments. PTOX attached tightly to the PSII-enriched membrane fragments. The amount of PTOX attaching to the membrane depended on pH and salts: an alkaline pH and monovalent compared to divalent cations increased PTOX attachment.PTOX activity in planta and its effect on photosynthetic electron transport were investigated using Arabidopsis expressing bacterial phytoene desaturase and tobacco expressing PTOX1 from Chlamydomonas. Arabidopsis expressing bacterial phytoene desaturase (CRTI lines) showed a higher PTOX content and increased PTOX related ROS generation. Furthermore, cyclic electron flow was suppressed in these lines. This implicates that PTOX competes efficiently with cyclic electron flow for PQH2 in the CRTI-expressing lines and that it plays a crucial role in the control of the reduction state of the plastoquinone pool. Using tobacco expressing PTOX1 from Chlamydomonas, it was shown that PTOX competes efficiently with photosynthetic electron flow, but gets inactive when the stromal pH is neutral. Based on the in vitro and in vivo results, a model is proposed, where the association of PTOX to the membrane is controlled by the stromal pH: When the stromal pH is neutral, PTOX exists as a soluble form and is enzymatically inactive avoiding the interference of PTOX with linear electron flow. When the stromal pH is alkaline and the photosynthetic electron chain is highly reduced under stress conditions as high light, PTOX binds to the membrane, gets enzymatically active and can serve as safety valve.


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