Mise au point d'un modèle de stéatose hépatique liée à l'obésité : application à l'étude de la toxicité du paracétamol

par Anaïs Michaut

Thèse de doctorat en Biologie et sciences de la santé

Sous la direction de Bernard Fromenty.

Soutenue le 09-07-2015

à Rennes 1 , dans le cadre de École doctorale Vie-Agro-Santé (Rennes) , en partenariat avec Université européenne de Bretagne (PRES) et de Nutrition, métabolismes et cancer (Rennes) (laboratoire) .


  • Résumé

    L'obésité et les maladies du foie associées (NAFLD) augmentent le risque et la sévérité de l’hépatotoxicité induite par certains xénobiotiques, mais les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Pour l'éthanol et le paracétamol (APAP), le rôle du cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) hépatique est suspecté car l'activité de cette enzyme est augmentée au cours de ces pathologies dysmétaboliques. Le 1er objectif de notre travail expérimental a été de mettre au point un modèle cellulaire de NAFLD caractérisé non seulement par l'accumulation de triglycérides mais aussi par l’augmentation de l'activité du CYP2E1. Pour cela, des cellules humaines HepaRG différenciées ont été incubées pendant une semaine avec de l'acide stéarique ou de l'acide oléique, en présence de 3 concentrations différentes d'insuline. Les triglycérides cellulaires et l'expression de gènes induits au cours de la stéatose étaient similaires avec les deux acides gras. Cependant, l'activité du CYP2E1 était significativement augmentée uniquement par le stéarate et ceci était associé à une diminution de l'activité du CYP3A4, une autre caractéristique des NAFLD. L’activité du CYP2E1 dans les cellules HepaRG était réduite par l'insuline d'une manière concentration-dépendante et cet effet était reproduit sur des hépatocytes humains en culture primaire. Ainsi, l'activité du CYP2E1 était la plus élevée dans les cellules HepaRG cultivées avec du stéarate et sans insuline. Le 2ème but de notre étude était ensuite d'évaluer la cytotoxicité de l’APAP sur des cellules HepaRG présentant ou non une stéatose et une induction du CYP2E1. Des expériences avec une large gamme de concentrations d’APAP (de 1 à 20 mM) indiquaient que la perte cellulaire d'ATP et du glutathion (GSH) était presque toujours plus forte en présence de stéarate. Dans les cellules prétraitées avec le chlorméthiazole (CMZ, un inhibiteur du CYP2E1), la moindre diminution d’ATP était plus importante en présence de stéarate, avec de faibles (2,5 mM) ou de fortes (20 mM) concentrations d’APAP. Cependant, en l'absence d'insuline, la moindre chute d’ATP induite par le CMZ était significativement plus forte uniquement pour 20 mM d’APAP. Étonnamment, suite au prétraitement par le CMZ, il n'y avait pas de protection vis-à-vis de la diminution du GSH et de la formation des adduits APAP-protéines. Enfin, les concentrations du métabolite APAP-glucuronide étaient significativement augmentées en présence d'insuline. Ainsi, lorsqu’elle est étudiée dans des conditions spécifiques de culture, la lignée cellulaire HepaRG semble être un modèle intéressant de NAFLD, notamment en ce qui concerne les activités du CYP2E1 et du CYP3A4. Nos données suggèrent aussi que l’induction du CYP2E1 observée au cours des NAFLD pourrait être secondaire à l'accumulation de certains acides gras et à la présence d’une faible signalisation insulinique dans le foie. Ainsi, ce modèle cellulaire peut être utilisé pour mettre en évidence les principaux facteurs métaboliques et hormonaux favorisant hépatotoxicité de l’APAP chez les personnes obèses. Cette thèse inclut également une revue de la littérature sur l’hépatotoxicité de l’APAP dans le contexte de l’obésité et des NAFLD (Michaut et al., Liver Int 2014).

  • Titre traduit

    Development of e cell model of liver steatosis related to obesity : application to the study of acetaminophen toxicity


  • Résumé

    Obesity and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) are able to increase the risk and the severity of hepatotoxicity induced by some xenobiotics including drugs, but the involved mechanisms are still poorly understood. For toxic compounds such as ethanol and acetaminophen (APAP), a role of hepatic cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) is suspected since the activity of this enzyme is consistently enhanced during obesity and NAFLD. The first aim of our experimental study was to set up a cellular model of NAFLD characterized not only by triglyceride accumulation but also by higher CYP2E1 activity. To this end, differentiated human HepaRG cells were incubated during one week with stearic acid, or oleic acid, in the presence of 3 different concentrations of insulin. Cellular triglycerides and the expression of lipid-responsive genes were similar with both fatty acids. However, CYP2E1 activity was significantly increased only by stearate and this was associated with lower CYP3A4 activity, another metabolic feature reported in NAFLD. CYP2E1 activity in HepaRG cells was reduced by insulin in a concentration-dependent manner and this effect was reproduced in cultured primary human hepatocytes. Hence, the highest CYP2E1 activity was observed in HepaRG cells with stearate and without insulin. Next, the second aim of our study was to assess APAP cytotoxicity in HepaRG cells presenting or not lipid accretion and CYP2E1 induction. Experiments with a large range of APAP concentrations (1 to 20 mM) showed that the cellular loss of ATP and glutathione (GSH) was almost always stronger in the presence of stearic acid. In cells pretreated with the CYP2E1 inhibitor chlormethiazole (CMZ), recovery of cellular ATP was significantly higher in the presence of stearic acid with both low (2.5 mM) and high (20 mM) concentrations of APAP. However, in the absence of insulin, CMZ-induced ATP recovery was significantly greater only for 20 mM of APAP. Surprisingly, there was no recovery of cellular GSH and no reduction of APAP-protein adducts following CMZ pretreatment. Finally, levels of APAP-glucuronide were significantly enhanced in the presence of insulin. Hence, when studied in specific conditions of culture, the HepaRG cell line can be a valuable model of human NAFLD, especially regarding CYP2E1 and CYP3A4 activity. Our data also suggest that higher CYP2E1 activity in NAFLD could be secondary to the hepatic accumulation of some fatty acids and to the presence of low insulin signaling. This cellular model can be thus used to unveil the main metabolic and hormonal factors favoring APAP hepatotoxicity in obese individuals. This thesis also includes a review on APAP hepatotoxicity in the context of obesity and NAFLD (Michaut et al., Liver Int 2014).


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