Étude du mécanisme moléculaire de formation des translocations chromosomiques dans les cellules humaines

par Hind Ghezraoui

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Erika Brunet et de Carine Giovannangeli.

Soutenue le 27-03-2015

à Paris 11 , dans le cadre de Ecole doctorale Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé (2000-2015 ; Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne) , en partenariat avec Laboratoire de structure et instabilité des génomes (Paris) (laboratoire) et de Structure et Instabilité des Génomes (laboratoire) .

Le président du jury était Patrick Calsou.

Le jury était composé de Erika Brunet, Carine Giovannangeli, Patrick Calsou, Pascale Bertrand, Françoise Dantzer, Yvan Canitrot.

Les rapporteurs étaient Patrick Calsou, Pascale Bertrand.

mots clés

• NHEJ
• Complexe X4/L4
• Fréquence de translocation
• Délétion
• Microhomologies
• ADN -- Réparation
• Translocation (génétique)
• Délétion chromosomique
• Réparation de l'ADN par jonction d'extrémités

Résumé

Les translocations chromosomiques qui consistent en l’échange de morceaux de chromosomes sont une des caractéristiques génétiques de nombreux cancers. Les séquences des jonctions des chromosomes transloqués chez les patients correspondent à une réparation par NHEJ. Nous avons étudié le rôle du complexe de ligation XRCC4/LigaseIV du C-NHEJ dans la formation de ces réarrangements chromosomiques dans les cellules humaines. Nous avons utilisé différentes nucléases artificielles (ZFN, TALEN, et CRISPR/Cas9) afin d'introduire deux CDB sur deux chromosomes et nous avons ainsi réussi à générer différentes translocations. Des lignées sauvages et mutantes pour ce complexe de ligation ont été utilisées et la fréquence formation de translocations a été quantifiée par PCR. Nous avons pu observer que celle-ci est souvent diminuée dans les différentes lignées mutantes. Les jonctions des translocations obtenues par séquençage sont modifiées dans des cellules déficientes pour ce complexe. En effet, elles présentent de longues délétions et un biais d’utilisation de microhomologies, indiquant l’utilisation d’un mécanisme alt-NHEJ. Une altération de cette voie dans les cellules humaines n’affecte d’ailleurs pas la formation de ces réarrangements chromosomiques. Ainsi, contrairement aux cellules de souris, les translocations dans les cellules humaines sont générées par le C-NHEJ.

mots clés

• NHEJ
• X4/L4 complex
• Translocation frequency
• Deletion
• Microhomologies

Titre traduit

Understanding Chromosomal Translocation Formation in Human Cells

Résumé

Chromosomal translocations involve the exchange of chromosome pieces and are often associated with oncogenesis. It has been shown that breakpoint junctions of translocated chromosomes found in patients are typical of a repair by NHEJ. Here we investigated the specific role of XRCC4/LigaseIV, the ligation complex of C-NHEJ, on chromosomal translocation formation in human cells. Using different nucleases (ZFN, TALEN, et CRISPR/Cas9) targeting two chromosomes, we studied the induction of translocation in wt and KO human cells, expressing or not the XRCC4/LigaseIV complex. We found that translocation frequency was mostly reduced in XRCC4/LigaseIV deficient cells when we quantified the induction of translocation by PCR. In addition, we analyzed the breakpoint junctions by sequencing. Strikingly, we found that junctions of translocations show large deletions, and a bias towards the use of longer microhomologies only in XRCC4/LigaseIV KO cells, signature of the alt-NHEJ activity. In contrast, translocation formation was not affected in alt-NHEJ deficient cells. Thus conflicting with results obtained in rodent cells where alt-NHEJ promotes translocation formation, translocations in human cells are generated by the C-NHEJ.