Elaboration d’un épiderme de culture et évaluation non clinique sur un modèle de brûlure cutanée

par Maïa Alexaline

Thèse de doctorat en Physiologie, physiopathologie

Sous la direction de Jean-Jacques Lataillade.


  • Résumé

    Les brûlures cutanées graves dont les lésions profondes et étendues des tissus ne permettent pas d’envisager un traitement classique par autogreffes, bénéficient aujourd’hui de substituts épidermiques autologues pour leur recouvrement. En effet l’ingénierie tissulaire permet l’obtention d’épiderme de culture autologue (CEA) par l’amplification in vitro de kératinocytes à partir d’une petite biopsie de peau saine. Si ces CEAs ont permis la survie de nombreux patients depuis les années 1980, ils n’en restent pas moins largement perfectibles du point de vue de l’esthétique et de la fonctionnalité de l’épiderme et de la jonction dermo-épidermique régénérés mais aussi en termes de coûts et de prévention des zoonoses.Ainsi, ce travail de thèse s’inscrit dans le cadre d’une recherche translationnelle et porte sur l’élaboration d’un épiderme de culture par ingénierie tissulaire en vue d’une application clinique chez les grands brûlés, afin de favoriser la cicatrisation et la régénération épidermique. Ce travail porte également sur l’évaluation non clinique de notre substitut épidermique sur un modèle animal de brûlure cutanée.Après avoir développé un nouveau substitut épidermique sur fibrine de plasma humain (hPBES : human Plasma-Based Epidermal Substitute), nous avons procédé à l’évaluation détaillée de ses caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles en comparaison au substitut épidermique de référence Epicel® (Genzyme, US). Nous avons montré des propriétés plus intéressantes en termes de clonogénicité et de caractère souche, de prévention de la différenciation, de prolifération, de potentiel de migration, et de conservation des protéines de la membrane basale avec notre produit par rapport à Epicel®.L’apport de la matrice de fibrine de plasma sur la culture des kératinocytes en comparaison à une matrice de fibrine issue de fibrinogène purifié et à une culture sans matrice a été étudié notamment sous l’angle des facteurs libérés par les matrices. Nous avons observé une amélioration des propriétés des substituts épidermiques par la fibrine : diminution de la différenciation terminale, augmentation du potentiel migratoire et sécrétion de facteurs pro-cicatrisants (GM-CSF et PDGF-BB). En outre, la fibrine de plasma améliore spécifiquement la morphogénèse épidermique, la prolifération kératinocytaire et la clonogénicité.Le procédé de culture de ce nouveau substitut a été adapté aux exigences réglementaires sans altération du potentiel régénératif: remplacement des cellules nourricières murines par des fibroblastes dermiques humains, adaptation du milieu de culture et sécurisation du plasma par traitement à l’amotosalen.Toutes les étapes d’un modèle de brûlure chez le rat nude reproduisant la technique chirurgicale employée pour la greffe de CEA ont été mises au point, mais un rejet du greffon épidermique n’a pas permis l’évaluation d’hPBES sur ce modèle. Nous avons donc évalué le substitut épidermique développé hPBES chez la souris NOD-SCID après greffe au fascia et mis en évidence une bonne prise de greffe épidermique permettant la régénération d’un épiderme humain aux caractéristiques proches d’une peau saine avec une réorganisation de la jonction dermo-épidermique des 2 semaines après greffe.

  • Titre traduit

    Development of a bioengineered epidermal substitute and non-clinical evaluation on a skin burn model


  • Résumé

    The deep and large injuries caused by massive burns prevent the use of split-thickness skin autografts. Today, autologous epidermal substitutes constitute an alternative treatment for skin regeneration. In fact tissue engineering allows the production of Cultured Epithelial Autografts (CEA) by in vitro keratinocyte amplification from a small healthy skin biopsy. The clinical use of CEA since the 1980’s has allowed an increase in the survival rate of burnt patients. However, CEAs present numerous drawbacks, among them the high fragility of keratinocyte sheets, and the immaturity of the dermal-epidermal junction leading to heavy cosmetic and functional sequelae.This thesis focuses on the bioengineering of epidermal substitute for clinical burn treatment to enhance wound healing and skin regeneration, from a translational research point of view. This work also includes the development of an animal model of third degree burn for the evaluation of epidermal substitute.We first developed a new epidermal substitute cultured on a fibrin matrix from human plasma (hPBES: human Plasma-Based Epidermal Substitute). Then we characterized this new substitute with phenotypical and functional analyses, using as a reference the epidermal substitute Epicel® (Genzyme, US). We observed properties more favorable with hPBES than with Epicel® in terms of clonogenicity, stemness, differentiation level, proliferation, migration potential and basement membrane protein conservation.The influence of the plasma-based fibrin matrix on keratinocytes was studied in comparison with a culture on a fibrin from purified fibrinogen, and with a culture with no matrix. For this study we focused our analysis on the role of the released factors from fibrin matrices during epidermal substitute culture. Both fibrin matrices improved epidermal substitute properties: reduction of terminal differentiation, enhancement of migration potential, secretion of wound healing enhancing factors. Besides, plasma-based fibrin specifically promote epidermal morphogenesis, keratinocyte proliferation and clonogenicity.The culture process was adapted to European regulation requirements without diminishing its regenerative potential: substitution of murine feeder cells by human dermal fibroblasts, adaptation of culture medium and plasma viral inactivation using amotosalen treatment.A burn model including all the surgical steps used in clinics for CEA grating was developed on nude rats. However the evaluation of hPBES on this model could not be achieved due to graft rejection. Therefore we evaluated epidermal regeneration after hPBES graft on acute wounds on NOD-SCID mice. We showed a good graft rate, with the regeneration of a human epidermis close to healthy epidermis with a well-organized dermal-epidermal junction two weeks after hPBES grafting.


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