Identification d'inhibiteurs physiologiques de métallo-ectopeptidases impliquées dans la réponse nociceptive

par Mouna Mahbouli

Thèse de doctorat en Biochimie et Biologie Moléculaire

Sous la direction de Marie-Sandrine Cadel et de Thierry Foulon.

Soutenue le 24-09-2015

à Paris 6 , dans le cadre de École doctorale Complexité du vivant (Paris) , en partenariat avec Institut de Biologie Paris-Seine (laboratoire) .

Le jury était composé de Olivier Lequin, Sarah Bonnet, Frédéric Ducancel, Philippe Holzmuller, Catherine Rougeot.


  • Résumé

    Chez les Mammifères, les enképhalines sont des neuromédiateurs peptidiques qui jouent un rôle clé dans le contrôle des voies de transmission de la douleur. Ces enképhalines sont très rapidement dégradées par 2 métallopeptidases membranaires, l’Endopeptidase neutre (NEP) et l’Aminopeptidase neutre (APN). Ces enképhalinases interrompent l’action analgésique de ces peptides et jouent un rôle crucial dans la modulation de la transmission douloureuse. Deux inhibiteurs physiologiques de ces enképhalinases ont été identifiés : la sialorphine chez le rat (QHNPR) et l’opiorphine chez l’homme (QRFSR). In vivo, ces pentapeptides sont capables d'induire une analgésie équivalente à celle de la morphine, sans ses effets secondaires. L’importance des fonctions physiologiques régulées par ces deux médiateurs nécessite la connaissance de leur(s) mécanisme(s) d’action afin de développer des molécules utiles au traitement des douleurs sévères et chroniques. Cependant, les connaissances actuelles sont limitées puisque la sialorphine et l’opiorphine demeurent des peptides singuliers. En effet, à ce jour, aucun analogue ou homologue fonctionnel n’a été caractérisé dans d’autres espèces animales. Nous nous sommes donc intéressés au modèle de la tique Ixodes ricinus, car sa morsure n’engendre pas de réactions nociceptives chez son hôte, laissant présager la sécrétion, via la salive, de substances anti-douleur puissantes. Ce modèle semblait donc pertinent pour la mise en évidence d’autres homologues de la super-famille de l’opiorphine et de la sialorphine. Les objectifs étaient : i) isoler et caractériser des peptides extraits de la salive ayant la capacité d’inhiber l’activité NEP et APN ; ii) identifier les gènes codant les précurseurs de ces peptides pour analyser leur parenté avec ceux de l’opiorphine et la sialorphine ; iii) identifier, à l’aide de ce marqueur phylogénétique, de nouveaux peptides « opiorphine-like » chez d’autres Invertébrés. A ce jour, aucun résultat probant n’a été obtenu, probablement du fait de l’utilisation d’une quantité insuffisante de matériels biologiques en rapport avec les techniques de fractionnement et d’analyses utilisées. En parallèle, nous avons recherché des homologues des précurseurs de l’opiorphine et de la sialorphine dans les banques de données de séquences. Les objectifs étaient : i) identifier l'ensemble de ces peptides ; ii) évaluer leur potentiel inhibiteur in vitro vis-à-vis de la NEP et de l’APN. Les analyses nous ont permis d’identifier chez certains Mammifères des analogues positionnels de ces inhibiteurs. Des tests préliminaires ont montré que la plupart d’entre eux étaient capables d’inhiber l’APN, certains avec une efficacité supérieure à celle de l’opiorphine. En revanche, un seul inhibiteur de la NEP a pu être mis en évidence. Dans le cadre de ma thèse, nous avons également étudié l’effet de différentes molécules naturelles sur l’activité de l’Aminopeptidase B (Ap-B). Les résultats obtenus montrent que la curcumine et la mangiférine inhibent l’Ap-B de manière non-compétitive.

  • Titre traduit

    Identification, structural and functional characterization of physiological inhibitors of metallo-­ectopeptidases involved in nociceptive response


  • Résumé

    In mammals, enkephalins are peptide neurotransmitters that play a key role in the control of the routes of pain transmission. These enkephalins are rapidly degraded by 2 membrane metallopeptidases, the neutral endopeptidase (NEP) and the neutral aminopeptidase (APN). These enkephalinases interrupt the analgesic action of these peptides and play a crucial role in modulating pain transmission. Two physiological inhibitors of these enkephalinases were identified: sialorphin in rats (QHNPR) and opiorphin in humans (QRFSR). In vivo, these pentapeptides are capable of inducing analgesia similar to that of morphine, without its side effects. The importance of physiological functions regulated by these two mediators requires knowledge of their mechanism of action to develop molecules useful in treatment of severe and chronic pain. However, current knowledge are limited, since sialorphin and opiorphin remain singular peptides. Indeed, to date, no similar or functional homologue has been characterized in other animal species.We are therefore interested to the model of the tick Ixodes ricinus, because its bite does not cause nociceptive responses in the host, suggesting secretion of powerful painkilling substances via saliva. This model seemed to be relevant for the detection of other members of the superfamily of opiorphin and sialorphin. The objectives were: i) isolate and characterize peptides extracted from saliva having the ability to inhibit the NEP and APN activities; ii) identify the genes encoding the precursors of these peptides to analyze their relationship with those of opiorphin and sialorphin; iii) identify, using this phylogenetic marker, new peptides "opiorphin-like" in other invertebrates. To date, no conclusive result has been obtained, probably due to the use of an insufficient amount of biological materials related to the techniques used. In parallel, we looked for homologs of opiorphin and sialorphin in sequence databases. The objectives were: i) identify all of these peptides; ii) assess their inhibitory potential, in vitro, against the NEP and APN. The analysis allowed us to identify in some mammals positional analogues of these inhibitors. Preliminary tests have shown that most of them were able to inhibit the APN, some with upper efficacy to opiorphin. But, only one NEP inhibitor has been highlighted. As part of my thesis, we also studied the effect of different natural molecules on the activity of the aminopeptidase B (Ap-B). The results obtained show that curcumin and mangiferine inhibit the Ap-B according to a non-competitive mechanism.

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