Exploration par résonance magnétique de l'espace conformationnel et de la dynamique du facteur de transcription partiellement désordonné Engrailed-2

par Shahid Nawaz Khan

Thèse de doctorat en RMN Biomoléculaire

Sous la direction de Fabien Ferrage et de Olivier Lequin.

Soutenue le 12-03-2015

à Paris 6 , dans le cadre de École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris) , en partenariat avec Laboratoire des biomolécules (laboratoire) .

Le jury était composé de Carine Tisne, Isabella C. Felli, Martin Blackledge, Germain Trugnan.


  • Résumé

    Les protéines intrinsèquement désordonnées (IDP), dépourvues d’une structure rigide et stable, constituent une classe de protéines diverses et fonctionnellement importantes. La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique spectroscopique bien établie pour caractériser les propriétés conformationnelles et dynamiques des IDP avec une résolution atomique. L’espace conformationnel, en général large et varié, des IPD en fait une cible difficile pour la biologie structurale dont le but est de déterminer avec précision et exactitude les propriétés structurales, dynamique et physico-chimiques qui sous-tendent la fonction des macromolécules biologiques. Ce manuscrit présente une étude biophysique détaillée de la région intrinsèquement désordonnée (IDR) du facteur de transcription Engrailed-2, avant tout par RMN. Après une présentation de cette homéoprotéine, nous décrivons les protocoles d’expression et de purification de cette protéine isotopiquement marquée. Nous introduisons ensuite une nouvelle approche pour la caractérisation des mouvements pico- et nanoseconde des protéines intrinsèquement désordonnées à partir de données de relaxation des spins nucléaires enregistrées à plusieurs champs magnétiques. Les effets de relaxation paramagnétique (PRE) ont été utilisés pour identifier des interactions transitoires entre la région désordonnée et l’homéodomaine d’Engrailed-2. L’interaction d’Engrailed-2 avec l’ADN a été étudiée en détail en utilisant l’anisotropie de fluorescence sur une série de constructions de la protéine, afin de mettre en lumière le rôle de la partie désordonnée dans l’interaction avec l’ADN. Nous avons également employé la résonance paramagnétique électronique pour tenter de détecter une interaction potentielle entre le noyau hydrophobe de l’hexapeptide dans la région désordonnée et l’homéodomaine. Les couplages dipolaires résiduels (RDC) dans les paires 1H-15N, Cα-Hα et Cα-C′ ont également été mesurés sur des échantillons d’Engrailed en milieu anisotrope. Ces données seront essentielles pour reconstituer l’espace conformationnel d’Engrailed 2. L’ensemble des approches présentées a permis de constituer un socle solide de connaissances qui permettent de mieux comprendre les propriétés conformationnelles, dynamiques et fonctionnelles de l’IDR d’Engrailed-2.

  • Titre traduit

    The conformational space and dynamics of the partially disordered transcription factor engrailed-2 explored with magnetic resonance


  • Résumé

    Intrinsically Disordered Proteins (IDPs), which lack a stable rigid structure constitute a large and functionally important class of proteins. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is a well-established technique to characterize the structural and dynamical features of IDPs at atomic resolution. The broad conformational space of IDPs makes them challenging targets for structural biology to define their precise structural features and motions, the physical and chemical properties that underlie their biological functions. The present thesis establishes biophysical investigation of the disordered region of the transcription factor Engrailed-2 (13.5 kDa) primarily by NMR. After describing the protocol of expression and purification of the isotopically labeled protein, we present a novel approach to characterize the pico – nano second motions in IDPs using nuclear spin relaxation data at multiple fields. Paramagnetic Relaxation Enhancements (PREs) are used to identify transient long-range interactions between the disordered region and the folded homeodomain of Engrailed-2. Binding to DNA was studied by fluorescence anisotropy and highlights the role of the disordered region in the DNA binding. We used Electron Paramagnetic Resonance (EPR) to probe the potential interaction between the hydrophobic cluster (hexapeptide) in the disordered region and the homeodomain. The one-bond 1H-15N, Cα-Hα and Cα-C′ residual dipolar couplings (RDCs) measured for Engrailed-2 provide important constraints for the refinement of the conformational space of Engrailed_2. All these approaches provide valuable insights in understanding the structural, dynamical and functional properties of this IDP.


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