Utilisation de la cryoconservation pour la conservation et la production de cultures in vitro de palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) : Impact d'un protocole de cryoconservation sur la physiologie des cals embryogènes de palmier dattier

par Mohammad Salma

Thèse de doctorat en BIP - Biologie Intégrative des Plantes

Sous la direction de Florent Engelmann.

Le président du jury était James Tregear.

Le jury était composé de Florent Engelmann, James Tregear, Marie-Anne Lelu, Agnès Grapin.

Les rapporteurs étaient Marie-Anne Lelu, Agnès Grapin.


  • Résumé

    Le palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) a une grande importance écologique et socio-économique dans les zones arides et semi-arides du globe. Cette espèce présente une grande diversité (plus de 2.000 variétés identifiées) qui est menacée par la production à grande échelle de variétés élites. Il est nécessaire de développer des techniques permettant de conserver cette diversité et de gérer la production des variétés élites multipliées in vitro. La cryoconservation (azote liquide, -196°C) est la seule technique disponible à l’heure actuelle permettant la conservation à long terme, à coûts réduits et en sécurité de cette diversité. Dans ce travail, nous avons comparé l’efficacité de deux techniques de cryoconservation, la vitrification en goutte (DV) et la D cryo-plate (DP), pour la cryoconservation de masses proembryogènes (PEM) de deux variétés de palmier dattier, Sokary et Sultany. Avec la DV, la survie des PEM cryoconservées est nulle sans prétraitement au saccharose (3 jours avec 0,5M) et sans traitement avec la solution de vitrification PVS2. Après 15 à 120 min de traitement avec PVS2, la survie est comprise entre 90,9-98,6% et 85,6-88,0%, respectivement pour Sokary et Sultany. Avec un prétraitement au saccharose, 21,1% des PEM de la variété Sokary survivent à la cryoconservation sans traitement avec PVS2. Avec la DP, un effet positif du prétraitement au saccharose est observé sur la survie des PEM cryoconservés. Pour Sokary, la survie la plus importante (de 92,0 à 95,8%) après congélation est obtenue pour des durées de dessiccation comprises entre 60 et 120 min. La survie après cryoconservation est comprise entre 67,0 et 74,6% après des durées de 90 à 120 min de dessiccation pour Sultany. Avec les deux techniques expérimentées, l'intensité de croissance des PEM cryoconservées est supérieure chez Sokary par rapport à Sultany. L’étude histologique réalisée montre qu’en l’absence de prétraitement, c'est le traitement de loading qui induit la plasmolyse des cellules la plus importante, d'environ 26, 40 et 50%, respectivement pour les cellules méristématiques, les cellules embryogènes de la population I (PopI) et de la population II (PopII) par rapport à leur état initial. Le prétraitement au saccharose induit une plasmolyse d'environ 50% uniquement chez les cellules de PopII. Le traitement de loading et de vitrification n'entraîne pas de plasmolyse supplémentaire. Aucune plasmolyse n'est observée chez les cellules méristématiques et les cellules de PopI. En revanche, les mesures de la surface de l'ensemble des cellules montrent chez les cellules méristématiques une diminution significative de surface après le prétraitement au saccharose, mais aucune différence significative après le traitement de loading et de vitrification. Chez les cellules embryogènes de PopI, une diminution supplémentaire de la surface est observée après le traitement de vitrification. L’étude de la circularité des noyaux montre une déformation permanente des noyaux des cellules non prétraitées des trois types cellulaires, alors que seuls les noyaux des cellules de PopII présentent cet aspect chez les PEM prétraitées. Enfin, l'étude du degré de méthylation des PEM par immunolocalisation conclut à l'absence de différences significatives entre les PEM témoins non traitées et les autres conditions expérimentales. Cependant, les tissus différenciés présentent un pourcentage de noyaux méthylés plus important par rapport aux cellules embryogènes et aucun marquage n'est noté chez les cellules méristématiques. Nos résultats ont permis de préciser l’effet de la cryoconservation sur l’intégrité structurale et la physiologie des PEM de palmier dattier. Ils contribuent également à la sauvegarde de la biodiversité du palmier dattier.

  • Titre traduit

    Use of cryopreservation for the conservation and production of date palm (Phoenix dactylifera L.) in vitro cultures : Impact of a cryopreservation protocol on the physiology of embryogenic callus of date palm


  • Résumé

    The date palm (Phoenix dactylifera. L) has a great ecological and socioeconomic importance in arid and semi-arid areas of the globe. This species displays a great diversity, with over 2,000 identified varieties, which is threatened by the large scale production of elite varieties. It is necessary to develop techniques allowing to conserve this biodiversity and to manage the production of in vitro propagated elite varieties. Cryopreservation (liquid nitrogen [LN], -196°C) is currently the only technique available ensuring the safe and cost-effective long-term conservation of this diversity. In this work, we compared the efficiency of two cryopreservation techniques, droplet-vitrification (DV) and D cryo-plate (DP), for the cryopreservation of proembryonic masses (PEMs) of two varieties of date palm, Sokary and Sultany. With DV, recovery of cryopreserved PEMs was nil without sucrose pretreatment (3 days, 0.5 M) and without treatment with PVS2 vitrification solution. After 15 to 120 min of PVS2 treatment, recovery was between 90.9-98.6% and 85.6-88.0% for Sokary and Sultany, respectively. Sucrose pretreatment led to 21.1% recovery of cryopreserved PEMs of variety Sokary without PVS2 treatment. Regrowth intensity of PEMs cryopreserved was generally lower in the Sultany variety compared to the Sokary variety. With DP, a positive effect of sucrose pretreatment on recovery of cryopreserved PEMs was observed. For Sokary, the highest recovery of PEMs (92.0 to 95.8%) after LN exposure was achieved for desiccation periods between 60 and 120 min. Recovery of cryopreserved PEMs of variety Sultany was between 67.0 and 74.6% after desiccation periods between 90-120 min. With DP, the regrowth intensity of cryopreserved PEMs was higher for variety Sokary compared to Sultany. The histological study performed showed that in absence of pretreatment, it was the loading treatment which induced the highest cell plasmolysis, with values of 26, 40 and 50% for meristematic, embryogenic PopI and PopII cells, respectively, compared to their initial state. Sucrose pretreatment induced a 50% plasmolysis only in PopII cells. The loading and vitrification treatments did not cause any additional plasmolysis. No plasmolysis was observed in meristematic or PopI cells. By contrast, the measurement of the surface of all cells revealed a significant decrease in the surface of meristematic cells after pretreatment, but no significant difference after the loading or vitrification treatments. In embryogenic PopI cells, an additional decrease in the cell surface was observed after the PVS2 treatment. The study of nuclei circularity showed a permanent deformation of nuclei of non-pretreated cells of the three cell types. In pretreated PEMs, only the nuclei of PopII cells displayed deformation. Finally, the study of the methylation degree in PEMs by immunolocalization revealed the absence of significant differences between the untreated controls and other experimental conditions. However, the differentiated tissues exhibited a higher percentage of methylated nuclei compared to embryogenic cells, while no stained nuclei were observed in meristematic cells. Our results allowed clarifying the effect of cryopreservation on the structural integrity and on the physiology of date palm PEMs. They also contribute to safeguarding of date palm biodiversity.


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