Contributions à l'étude de la réponse moléculaire à l'hypoxie : Modélisation mathématique et expérimentations sur cellules FUCCI

par Baptiste Bedessem

Thèse de doctorat en Modèles, méthodes et algorithmes en biologie, santé et environnement

Sous la direction de Angélique Stéphanou.

Le président du jury était Xavier Ronot.

Le jury était composé de Annabelle Ballesta.

Les rapporteurs étaient Carine Michiels, Olivier Saut.


  • Résumé

    Les effets biologiques de l'hypoxie sont très étudiés aujourd'hui, principalement en raison du rôle crucial que jouent les conditions d'oxygénation dans le développement des cancers.Depuis plusieurs années, une littérature foisonnante tente ainsi de décrire les multiples aspects de la réponse moléculaire, cellulaire et physiologique à l'hypoxie. La complexité des voies de signalisation impliquées et la diversité de leurs effets cellulaires rendent la tâche délicate. Cet état de fait se reflète dans la pluralité des méthodes utilisées, depuis les simulations numériques jusqu'aux approches expérimentales.Dans cette thèse, j'ai abordé ce sujet sur la base de deux outils: la modélisation mathématique et une démarche expérimentale utilisant les cellules HeLa-FUCCI. Cette lignée cellulaire récemment développée est en effet un instrument de choix encore peu exploité. Par une construction génétique liant des protéines du cycle cellulaire à un fluorophore, elle rend possible l'étude, en continue, de la dynamique du cycle en microscopie de fluorescence. Nous avons ainsi pu analyser plusieurs aspects de la réponse cellulaire à l'hypoxie, dans un contexte tumoral.Dans un premier temps, nous avons cherché à caractériser mathématiquement les liens tissés entre le cycle cellulaire et les voies de signalisation de l'hypoxie, centrées sur le facteur de transcription HiF-1. Ce modèle propose un explication simple à l'arrêt du cycle observé notamment dans les cellules tumorales en conditions hypoxiques. Nous avons ainsi montré que l'induction de chimiorésistance pouvait se concevoir comme une entrée facilitée en quiescence des cellules cancéreuses. Dans le but de valider ces observations, nous avons ensuite cherché à quantifier expérimentalement la dynamique de la prolifération cellulaire en utilisant les cellules HeLa-FUCCI. Comme il est apparu que les fluorophores qu'elles portent sont sensibles au manque d'oxygène, nous avons testé différentes molécules couramment utilisées pour induire HiF-1 et mimer l'hypoxie (DFO et CoCl2). De cette étude ont émergé des résultats originaux quant à la dynamique de blocage du cycle des cellules HeLa en présence de chélateurs du fer.Si les conditions hypoxiques ne sont pas favorables à l'utilisation des cellules FUCCI, nous avons pu en revanche montrer qu'elles étaient tout à fait adaptées à l'étude de la dynamique du cycle cellulaire en condition de réoxygénation. De manière intéressante, nous avons alors pu observer un ralentissement significatif de la phase S après retour à la normoxie. Afin d'apporter un éclairage théorique à cette observation, nous avons proposé un modèle mathématique de la dynamique de régulation de HiF-1 en conditions d'oxygène fluctuantes, basé sur le couple HiF-1/pVHL, dont les relations sont pensées dans un cadre compartimenté (noyau/cytoplasme). Ce modèle simple reproduit fidèlement les caractéristiques principales de la réponse cellulaire à l'hypoxie. En outre, en simulant les conséquences d'une réoxygénation brutale, nous avons observé la genèse de fortes instabilités du niveau intracellulaire de HiF-1. Enfin, nous avons mené une étude expérimentale de la compartimentation de HiF-1. L'outil FUCCI permet en effet d'observer simultanément l'avancement du cycle (en microscopie de fluorescence), et la localisation intra-cellulaire de HiF-1(par immunomarquage). Nous avons pu montrer que la variabilité de la localisation de HiF-1α n'était pas due à la progression dans le cycle. Elle est donc certainement liée soit à des différences génétiques inter-cellulaire, soit à une stochasticité de la régulation de HiF-1.

  • Titre traduit

    Contributions to the study of the cellular response to hypoxia : Mathematical modeling and exprerimentations on HeLa-FUCCI cells


  • Résumé

    The biological effects of hypoxia are intensively studied today, mainly because of the crucial role played by oxygenation conditions during the development of cancers.For several years, a huge literature aims at describing the multiple aspects of the molecular, cellular and physiological responses to hypoxia. The complexity of the pathways which are involved and the diversity of their cellular effects make this task difficult.This situation is reflected in the plurality of the methods used, from the numerical simulations to the experimental approaches.In this thesis, I studied this subject using two tools: mathematical modeling and experimental approaches using HeLa-FUCCI cells.This recently developed cell line is an interesting tool not yetmuch exploited. By a genetic construction linking cell cycle proteins to a fluorophore, it makes possible the study of cell cycle dynamics using fluorescent microscopy.We could analyze various aspects of the cellular response to hypoxia, in a tumoral context. In a first time,we tried to mathematically characterize the links existing between cell cycle and the hypoxia pathways,driven by HiF-1.This model proposed a simple explanation to the cell cycle arrest notably observed in the tumor cells in hypoxicconditions.We then showed that the induction of chemoresistances could be considered as an entry into quiescence of tumor cells.In order to validate these observations we then tried to experimentally quantify the dynamics of cell proliferation using HeLa-FUCCI cells. As it appeared that the fluorophores were sensitive tothe lack of oxygen, we tested different molecules currently used to induceHiF-1 and mimic hypoxia (DFO and COCl2).From this study have emerged original results about the dynamics of cell cyclearrest of HeLa cells in presence of iron-chelators.If hypoxic conditions are not favorable to the use of HeLa-FUCCI cells, we could show that they were totally adapted to the study of cell cycle dynamics during reoxygenation.Interestingly, we then could observe a significant slowing down of the S-phase after the return to normoxia. In order to bring theoretical elements to this observation, we proposed a mathematical model of the dynamics of HiF-1 regulation in fluctuating oxygen conditions, based on thepVHL/HiF-1 couple, in the frame of a nucleo-cytoplasmic compartmentalization of HiF-1.This simple model well reproduce the main characteristics of the cell response to hypoxia.Besides, by simulating the consequences of a sudden reoxygenation, we observed the genesis of strong instabilities of HiF-1 intracellular level.Finally, we propose an experimental study of HiF-1 compartmentalization.Indeed, the FUCCI cells allow to simultaneously observe cell cycle progression (using fluorescent microscopy),and HiF-1 intra-cellular localization (with immunomarkage). We then could show that the variability of HiF-1 localization was not due to the progression into the cell cycle. Then, it is certainly linked to inter-cellular genetic differences, or to a stochasticity of HiF-1 regulation.


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