Investigation of Toxin-Cell Interactions and Receptor Confinement in the Cell Membrane

par Maximilian U. Richly

Thèse de doctorat en Physique

Sous la direction de Antigoni Alexandrou.

Soutenue en 2015

à Palaiseau, Ecole polytechnique .

  • Titre traduit

    Investigation des Interactions Toxine-Cellule et du Confinement des Récepteurs dans la Membrane Cellulaire


  • Résumé

    La membrane cellulaire est l’interface de communication et d’échange entre la cellule et le monde extérieur. En tant que telle, sa structure et composition ont une importance centrale à la viabilité de la cellule. Les protéines qui résident dans la membrane apportent la fonctionnalité nécessaire pour permettre à la membrane d’accomplir ces tâches. Ces récepteurs se retrouvent dans un environnement de haute hétérogénéité qui renforce leur efficacité. Nous avons étudié cet environnent en suivant des récepteurs uniques dans la membrane grâce aux nanoparticules dopées aux terres rares. Ces nanoparticules produisent des signaux continus, non-interrompus, permettant de suivre des trajectoires pendant plusieurs minutes. Nous avons ensuite utilisé une méthode basée sur l’inférence bayésienne pour analyser et comparer les trajectoires obtenues, et pour extraire le potentiel de confinement de forme arbitraire correspondant à chaque trajectoire. Nous avons d’abord validé l’approche de l’inférence bayésienne en démontrant que cette méthode peut également être utilisée pour la calibration d’un montage de pinces optiques. Par ailleurs, nous avons démontré que cette approche est supérieure aux techniques couramment utilisées pour la calibration des pinces optiques. Puis, nous avons appliqué cette méthode aux trajectoires des récepteurs de la toxine epsilon (de Clostridium perfringens) dans des cellules rénales canines Madin- Darby (MDCK). En particulier, nous avons étudié l’évolution du potentiel de confinement et de la diffusivité à l’intérieur des domaines confinant les récepteurs pendant l’action d’un agent déstabilisant les domaines de confinement, ainsi que les événement de ‘hopping’ pendant lesquels le récepteur change de domaine de confinement, et déterminé les énergies de ‘hopping’ associées. De plus, nous avons observé l’effet d’une force externe appliquée au récepteur, produite par un flux hydrodynamique. L’application d’une force a mis en évidence une dépendance du confinement des récepteurs du cytosquelette d’actine en plus du confinement produit par la distribution des lipides. Pour approfondir notre investigation du confinement des récepteurs de la membrane, nous avons classifié les potentiels de confinement obtenus pour les récepteurs résidant à l’intérieur et à l’extérieur des radeaux lipidiques. Les potentiels ressentis par les récepteurs en dehors des domaines lipidiques sont plus plats au centre du domaine de confinement et plus abrupts vers les bords du domaine par rapport aux potentiels ressentis par les protéines dans les radeaux. Enfin, nous avons étendu la technique de suivi de particules uniques en 3D en utilisant la largeur de la fonction de réponse du signal de la nanoparticule. De cette manière, nous avons observé le mouvement d’internalisation de nanoparticules couplées à un fragment de la chaine lourde de la toxine botulique A de Clostridium botulinum dans des cellules intestinales de souris de la lignée m-ICcl2.


  • Résumé

    The cell membrane is the interface of communication and exchange between the cell and the outside world. As such, its structure and composition is of integral importance to the cell’s continued survival. The proteins within the membrane provide the necessary functionalities to the membrane for successfully acting out its role. The membrane receptors experience a highly heterogeneous environment in the cell membrane that enhances their efficiency. We studied this environment via single particle tracking of cell membrane receptors tagged with luminescent lanthanide-doped nanoparticles. The nanoparticles provided a continuous, uninterrupted signal of the movements, yielding trajectories of several minutes. We then used a method based on statistical Bayesian inference to analyse and compare the trajectories obtained and, hence, extract a confinement potential of arbitrary shape. We first validated the Bayesian inference approach by demonstrating that this method can also be used to calibrate an optical tweezers setup. Furthermore, we showed that this method outperforms established calibration methods for optical traps. We then applied this approach to the confined trajectories of epsilon-toxin (produced by Clostridium perfringens) receptors in Madin-Darby canine kidney cells. In particular, we studied the evolution of the confinement potential and diffusivity within the domains upon addition of domain-destabilizing agents, as well as the occasional ‘hopping’ events, during which receptors are seen to hop into an adjacent confinement domain, and the associated 'hopping' energies. Additionally, we inquired into the effect of an externally applied force, implemented via a hydrodynamic flow on the receptors, and discovered an actindependent confinement of the microdomains in addition to the lipid-dependent confinement. To further investigate the nature of membrane receptor confinement, we classified the potentials obtained from raft and non-raft proteins using a decisiontree method and a clustering algorithm. The results showed that non-raft proteins reside in domains that produce a steeper potential boundary with a flatter potential in the centre of the domain as compared to raft proteins. Finally, we extended the single-particle tracking of toxins to three dimensions by registering the width of the point-spread function of the nanoparticle signal. In this way, we were able to observe the internalization trajectory of a heavy-chain segment of the botulinum toxin A of Clostridium botulinum in cells of the intestinal mouse cell line m-ICcl2.

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  • Détails : 1 vol. (190 p.)
  • Annexes : Bibliographie : 301 réf.

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