Rôle de la voie sphingomyelinase neutre de type 2 - sphingosine kinase 1 - sphingosine-1-phosphate dans l'effet angiogénique des LDL oxydées

par Caroline Camaré

Thèse de doctorat en Physiopathologie

Sous la direction de Robert Salvayre et de Anne Nègre-Salvayre.

Soutenue en 2014

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    L'athérosclérose et ses complications cardiovasculaires représentent la principale cause de morbi-mortalité dans les pays développés et posent un problème majeur de santé publique. De nombreux facteurs de risque, ont été décrits, en particulier l'hypercholestérolémie liée aux LDL circulantes. L'oxydation de ces LDL constitue une étape déterminante dans le processus d'athérogénèse. Dans la paroi des artères de moyen et gros calibre, on observe un réseau microvasculaire (les vasa vasorum) localisé au niveau de l'adventice et qui a pour rôle d'apporter oxygène et nutriments aux couches les plus externes de la paroi artérielle. Alors que ces microcapillaires ne sont pas retrouvés au niveau de la media et de l'intima des artères normales, il se produit une neovascularisation en regard de l'hyperplasie intimale des artères athéroscléreuses. Les LDL oxydées, par leur effet proangiogénique, peuvent contribuer à cette neovascularisation qui participerait à l'expansion de la plaque mais augmenterait aussi le risque d'hémorragies intraplaques ainsi que le risque de rupture et d'accidents athérothrombogènes. Le mécanisme angiogénique des LDLox est peu connu, et l'implication de la sphingosine-1-phosphate (S1P), un second messager de la voie des sphingolipides, impliqué dans l'angiogenèse, n'a pas été rapporté dans l'angiogenèse induite par les LDLox. Le but de ce travail est d'évaluer l'implication et les mécanismes d'activation de la voie des sphingolipides, avec la génération consécutive de S1P, dans l'effet pro-angiogénique des LDL oxydées sur les cellules endothéliales microvasculaires. Dans une première partie nous avons montré un effet biphasique des LDL oxydées sur les HMEC-1 (Human Microvascular Endothelial Cells), avec un effet proangiogénique à faibles doses (20 à 50µg/ml) et une absence d'angiogenèse pour des doses plus élevées non encore toxiques (100 µg/ml). Au-delà de ces doses, nous observons un effet toxique, comme cela a déjà été précédemment décrit. L'inhibition par siRNA de l'expression de SK1 (sphingosine kinase-1 impliquée dans la génération de S1P) et l'utilisation d'un anticorps bloquant de la S1P (Sphingomab(tm)), permettent d'inhiber efficacement la tubulogenèse des cellules endothéliales induite par les LDLox in vitro. L'angiogenèse chez la souris C57/Bl6 (étudiée par Matrigel plugs contenant des LDL oxydées), est efficacement prévenue par l'administration de l'anticorps bloquant Sphingomab(tm), définissant le rôle majeur de ce lipide bioactif dans le signal angiogénique des LDLox in vitro et in vivo. Sur un plan mécanistique, l'activation de SK1 et l'angiogenèse induite par les LDLox sont bloquées par l'utilisation d'anticorps bloquants anti-CD36 et anti-LOX-1 montrant l'implication des récepteurs scavengers des LDLox dans cette signalisation. L'utilisation d'un inhibiteur de l'activité kinase du VEGFR2 bloque dans une même proportion l'angiogenèse induite par les LDLox et par de la S1P exogène, évoquant une transactivation du VEGFR par les récepteurs membranaires de la S1P, en l'absence de synthèse de VEGF par les HMEC-1 sous l'effet des LDLox. Dans une deuxième partie nous avons montré que la génération de S1P consécutive à l'activation de la SK1 sous l'effet des LDLox, est étroitement liée à l'activation en amont de la nSMase2 dans des cellules endothéliales in vitro, impliquant également le stress oxydant et p38MAPK. L'utilisation d'un inhibiteur chimique de la nSMase2 bloque efficacement l'angiogénèse induite par les LDLox in vitro, ainsi que l'activation de SK1. Le time-course de génération de ROS et de phosphorylation de p38 dans les HMEC-1 soumises à des doses angiogéniques de LDLox est plus précoce que l'activation des enzymes de la voie des sphingolipides. L'utilisation des antioxydants NAC et trolox ainsi qu'un inhibiteur de phospho-p38MPAK bloquent à la fois la tubulogenèse et l'activation de nSMase2 et de SK1 in vitro, évoquant leur implication dans cette signalisation en amont de la voie des sphingolipides. Dans une troisième partie nous avons étudié le lien entre l'activation de la voie des sphingolipides par les LDLox et la connexine-43, protéine constitutive des jonctions gap permettant la transduction d'une signalisation entre cellules adjacentes. Grâce à l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques des connexines, nous avons obtenu une inhibition efficace de l'activation de la SK1 et de la tubulogenèse induite par les LDLox in vitro, permettant d'évoquer la participation des jonctions gap dans la transduction du signal angiogène des LDLox impliquant la génération de S1P. En prespective à ce travail, nous projetons d'approfondir les mécanismes impliquant la connexine-43 dans cette signalisation notamment par rapport à la nSMase2 et à p38MPAK et d'établir un lien avec le développement de la vascularisation des plaque in vivo à l'aide de marquage de SK1 ou connexine-43 sur des échantillons d'artériectomie carotidienne. Ces travaux mettent en évidence de nouvelles cibles (S1P, connexine-43) impliquées dans le mécanisme de la néoangiogenèse intraplaque, évoquant de nouvelles perspectives thérapeutiques pour limiter les complications athérothrombogènes grèvant de façon importante le pronostic des patients atteints d'athérosclérose.

  • Titre traduit

    Role of the neutral sphingomyelinase type 2 - sphingosine kinase 1-sphingosine-1-phosphate pathway in the angiogenic effect of oxidized LDL


  • Résumé

    Atherosclerosis and relative complications represent the main cause of morbi-mortality in western countries and arise a major problem for public health. Many risk factors have been described, in particular hypercholesterolemia linked to circulating LDL. The oxidation of LDL constitutes a decisive stage in atherogenesis. The vascular wall of the medium and large arteries is vascularized by a microcapilaries plexus (vasa vasorum) located in adventice, and in charge to bring oxygen and nutrients to the most external layers of the arterial wall. Although, no capillaries are found in the intima or media of normal arteries, we observe neovascularization under intimal hyperplasia of atherosclerotic arteries. As oxidized LDL could display angiogenic properties, they may contribute to this neovascularization, taking part in plaque growth but also in increasing risk of intraplaque heamorrage and destabilization leading to atherothrombotic complications. The angiogenic mechanisms of oxidized LDL is yet incompletely known, and the involvement of sphingosine-1-phosphate (S1P), a second messenger of sphingolipid pathway, well known for its angiogenic properties, has never been reported in oxLDL-induced angiogenesis. The aim of this work is to evaluate the involvement of sphingolipid pathway and its mechanisms of activation, with subsequent generation of S1P, in proangiogenic effects of oxidized LDL on microvascular endothelial cells. In a first part, we have demonstrated a biphasic effect exhibited by oxidized LDL in HMEC-1 (Human Microvascular Endothelial Cells), low oxLDL concentrations (20 to 50µg/ml) being angiogenic, whereas higher concentrations being not toxic yet (100µg/ml) are non angiogenic. Beyond these concentrations, as expected, a toxic effect was observed. Inhibition of SK1 (sphingosine kinase-1) expression by using a specific SiRNA, and use of S1P blocking antibody (Sphingomab(tm)), exibit an efficient inhibition of oxLDL-induced tubulogenesis of endothelial cells in vitro. Angiogenesis in C57/Bl6 mice (using Matrigel plug assay containing oxLDL), is efficiently prevented by administration of the S1P blocking antibody Sphingomab(tm), defining the major role of this bioactive lipid in the oxLDL angiogenic signal, in vitro and in vivo. Mechanisticaly speaking, ox-LDL-induced SK1 activation and angiogenesis are blocked by using anti-CD36 and anti-LOX-1 blocking antibody, showing the involvement of oxLDL scavenger receptors in this signaling. The use of a sphingosine kinase inhibitor of VEGFR2 blocks ox-LDL-induced angiogenesis in the same range as exogenous S1P-induced angiogenesis, evoking a cross-talk between VEGFR and membranary S1P receptors, in the absence of ox-LDL-induced VEGF synthesis in HMEC-1. In a second part, we have shown that ox-LDL-induced SK1 activation and subsequent S1P synthesis, was tightly linked to the amoung nSMase2 activation in endothelial cells in vitro, involving also oxidative stress and p38MPAK. The use of a chemical inhibitor of nSMase2 efficiently blocks both ox-LDL-induced angiogenesis and SK1 activation in vitro. The time course of ROS generation and p38MAPK phosphorylation in HMEC-1 submitted to angiogenic doses of oxLDL appears earlier than enzymes activation of sphingolipid pathway. Using antioxydants as NAC and trolox, as well as a phospho-p38MPAK inhibitor, we block both angiogenesis and nSMase2 and SK1 activation in vitro, evoking implication of oxidative stress and p38MPAK in this signalling amoung of sphingolipid pathway. In a third part, we have studied the link between oxLDL induction of sphingolipid pathway and connexine-43, a constitutive protein of gap junctions allowing signal transduction between adjacent cells. Through the use of two connexine pharmacological inhibitors, we have obtained an efficient inhibition of oxLDL-induced SK1 activation and tubulogenesis in vitro, evoking that gap junctions may take part in oxLDL angiogenic signalling, implicating S1P generation. In the perspective of this work, we plan to intensify the knowlegde of mechanisms involving connexine-43 in this signaling, particularly in relation to sphingolipid pathway and p38MAPK. Thereafter we would like to establish a link between this work and the developement of plaque neovascularization in vivo, in support of SK1 or connexines-43 staining on endarterectomy samples of human carotids from patients. These results arise new targets (S1P, connexine-43) implicated in development of intraplaque neoangiogenesis, and new therapeutic possibilities to limit atherothrombotic complications that significantly worsen the prognosis of atherosclerotic patients.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (193 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 173-193. Annexes

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2014 TOU3 0274
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