Bases cellulaires et moléculaires du rôle de la Sphingosine 1-phosphate dans la progression et la résistance du mélanome cutané

par Marie-lise Bats

Thèse de doctorat en Physiopathologie

Sous la direction de Nathalie Andrieu-Abadie et de Thierry Levade.

Soutenue en 2014

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    Le mélanome métastatique est considéré comme un des cancers les plus agressif et chimiorésistant chez l'Homme. Malgré les avancées dans la compréhension de la biologie et de la génétique du mélanome, les thérapies systémiques s'avèrent inefficaces pour combattre ce cancer très invasif. De nombreux arguments renforcent la notion que le microenvironnement tumoral jouerait un rôle clé dans la progression de cette tumeur. C'est pourquoi la définition des mécanismes moléculaires qui régissent le dialogue bidirectionnel entre les cellules malignes et le stroma tumoral semble indispensable à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques anti-mélanome. La première étape de notre travail s'est concentrée sur le rôle de la Sphingosine 1-phosphate (S1P), un sphingolipide bioactif décrit dans le cancer pour ses effets pro-migratoire et anti-apoptotique, dans les interactions mélanome-stroma. Par analyse transcriptomique, nous avons mis en évidence que l'expression la Sphingosine kinase 1 (SK1), l'enzyme qui produit la S1P, était augmentée dans des lignées de mélanome humain comparées à des mélanocytes sains. Cette augmentation, confirmée in situ dans des tissus de patients atteints de mélanome, était la conséquence directe de l'activation de ERK dans les cellules mutées pour BRAF ou NRAS. Bien que les modifications de l'expression de SK1 n'aient pas affecté la migration des cellules de mélanome, celle-ci a été stimulée par la modulation des enzymes du métabolisme de la S1P dans des fibroblastes dermiques co-cultivées avec les cellules tumorales. De plus, l'incubation de ces fibroblastes avec du milieu conditionné issu de cellules de mélanome surexprimant SK1 a conduit à leur différenciation en myofibroblastes, capables de produire des métalloprotéases matricielles et de sécréter de la S1P. Des expériences de tumorigenèse in vivo ont montré que l'absence de S1P dans le microenvironnement limitait la formation de tumeurs mélaniques chez les souris. De plus, la croissance tumorale locale et les métastases étaient considérablement augmentées par la co-injection de fibroblastes cutanés sauvages par rapport à des fibroblastes issus de souris Sphk1-/-. L'ensemble de nos résultats démontre que l'axe SK1/S1P pourrait contrôler les interactions entre le mélanome et son microenvironnement, soulignant l'intérêt de cibler la SK1 en thérapeutique. Notre équipe avait précédemment montré que l'expression de la S1P Lyase, l'enzyme responsable de la dégradation irréversible de la S1P, était fortement diminuée dans des cellules de mélanome comparée à des mélanocytes sains. La deuxième partie de notre travail s'est donc intéressée au rôle de cette enzyme dans la régulation de la réponse du mélanome au traitement par la dacarbazine (DTIC), un agent alkylant utilisé en 1ère ligne dans la prise en charge des mélanomes avancés. Nous avons montré que l'inhibition de l'expression de la S1P Lyase par siRNA augmentait la résistance au DTIC. A l'inverse sa surexpression sensibilisait les cellules de mélanome à l'apoptose en diminuant l'expression des membres anti-apoptotiques et à l'inverse en augmentant celle des membres pro-apoptotiques de la famille de Bcl-2. De plus, nous avons observé que le traitement des cellules de mélanome avec l'ABT-737, un inhibiteur de Bcl-2, s'accompagnait d'une action cytotoxique synergique avec les effets sensibilisants de la S1P Lyase en réponse au DTIC. De façon intéressante, la surexpression de la S1P Lyase stimulait l'expression de p53, via la régulation négative d'un de ses régulateurs clés, Mdm4. Les A375 surexprimant la S1P Lyase présentaient également une expression diminuée pour MITF (Microphthalmia-associated transcription factor), régulateur majeur de la mélanogenèse et de la progression du mélanome, également connu pour induire la transcription de Bcl-2. Enfin, la S1P Lyase activait PTEN par diminution de sa phosphorylation. En contrôlant l'expression de protéines clés dans la régulation des voies apoptotiques, la S1P Lyase pourrait donc être une nouvelle cible thérapeutique permettant d'améliorer la prise en charge des malades atteints de mélanome, notamment ceux qui développent des résistances aux thérapies émergentes.

  • Titre traduit

    Cellular and molecular bases of the role of sphingosine 1-phosphate in the progression and the resistance of cutaneous melanoma


  • Résumé

    Metastatic melanoma is considered to be one of the most aggressive and treatment-resistant human cancer. Despite advances in the understanding of tumor biology and genetics of melanoma, until recently systemic therapy was ineffective against this invasive cancer. Many evidences support the notion that the adjacent microenvironment plays a key role in the progression of this tumor. Defining the molecular signals that control the bidirectional dialogue between malignant cells and the surrounding stroma is crucial for efficient targeted therapy. The first part of our work aimed at defining the role of sphingosine-1-phosphate (S1P), a bioactive sphingolipid that promotes tumor cell migration and survival, in melanoma-stroma interactions. Transcriptomic analysis of human melanoma cell lines showed an increased expression of sphingosine kinase-1 (SK1), the enzyme that produces S1P, as compared to normal melanocytes. Such an increase was also observed by immunohistochemistry in melanoma specimens as compared to nevi, and occurred downstream of ERK activation due to BRAF or NRAS mutations. Importantly, migration of melanoma cells was not affected by changes in SK1 in tumor cells but was stimulated by comparable modifications of S1P-metabolizing enzymes in co-cultured dermal fibroblasts. Reciprocally, incubation of fibroblasts with the conditioned medium from SK1-expressing melanoma cells resulted in their differentiation to myofibroblasts, increased production of matrix metalloproteinases, and enhanced SK1 expression and activity. In vivo tumorigenesis experiments showed that the lack of S1P in the microenvironment prevented the development of orthotopically injected melanoma cells. Finally, local tumor growth and dissemination were enhanced more efficiently by co-injection of wild-type skin fibroblasts than by fibroblasts from Sphk1-/- mice. Altogether, our findings demonstrate that SK1/S1P can modulate the communication between melanoma cells and dermal fibroblasts, pointing out the relevance of SK1 as a potential therapeutic target in melanoma progression. Moreover, we previously reported that S1P Lyase expression, the enzyme responsible for irreversible degradation of S1P, was down-regulated in human skin melanoma cells as compared to normal melanocytes. The second part of our work aimed at defining the effect of S1P Lyase on the response of melanoma cells to antitumor therapies. Here we showed that disruption of S1P Lyase by siRNA enhanced resistance of A375 melanoma cells to Dacarbazine (DTIC), the common chemotherapy used to treat advanced melanoma. In contrast, we reported increased apoptosis in melanoma cells expressing S1P Lyase, as a consequence of increased expression of pro-apoptotic and decreased anti-apoptotic members of the Bcl-2 family. Moreover, S1P Lyase-induced cell death was enhanced in tumor cells treated by the Bcl-2 antagonist ABT-737 suggesting that S1P Lyase could act as a new regulator of Bcl-2-mediated cell survival in melanoma. Interestingly, S1P Lyase overexpression was also associated with an increased expression of p53 as a consequence of the downregulation of its key regulator Mdm4. Furthermore, A375 cells overexpressing S1P Lyase exhibited a decreased expression of Microphthalmia-associated transcription factor (MITF), one of the master regulators of melanogenesis and melanoma progression, also known to up-regulate Bcl-2 transcription. Finally, S1P Lyase promoted PTEN activation by decreasing its phosphorylation. By controlling the expression of key proteins in the regulation of apoptotic pathways, SPL could be a new target to improve the efficacy of anti-melanoma therapies.

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  • Détails : 1 vol. (253 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 235-251

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  • Cote : 2014 TOU3 0034
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