Biophysical investigation of the membrane and nucleic acids interactions of the transfection peptide LAH4-L1 : molecular mechanisms of complex formation and cellular entry

par Nataliia Voievoda

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Burkhard Bechinger et de Joachim Seelig.

Soutenue le 25-06-2014

à Strasbourg en cotutelle avec l'Universität Basel , dans le cadre de École doctorale Sciences chimiques (Strasbourg ; 1995-....) , en partenariat avec Institut de chimie (Strasbourg) (laboratoire) .

Le président du jury était Emmanuelle Leize-Wagner.

Le jury était composé de Sebastian Hiller.

Les rapporteurs étaient Sandro Keller, Christina Sizun.

  • Titre traduit

    Etudes des interactions de la membrane et des acides nucléiques aves le peptide de transfection LAH4-L1 : mécanismes moléculaires de formation de complexes et d'entrée cellulaire


  • Résumé

    La thérapie génique et l'interférence par l'ARN sont des méthodes pleines de promesses pour le traitement de nombreux troubles génétiques et infections virales, mais ce sont aussi des outils polyvalents pour l'étude des mécanismes génétiques et épigénétiques à la base du bon fonctionnement ou dysfonctionnement des cellules et des organismes complexes. Toutefois, la délivrance intracellulaire d'acides nucléiques reste un obstacle majeur pour la mise en œuvre de ces thérapies. En dépit des progrès récents dans le domaine, il existe un nombre limité d'agents de transfection non viraux qui ont passé à la phase clinique de la mise au point de médicaments. Un agent de transfection efficace forme un complexe (généralement non-covalent) avec des acides nucléiques, qui est stable dans l'environnement extracellulaire, en particulier dans le plasma sanguin. En outre, il doit favoriser la délivrance cellulaire en interagissant avec la membrane plasmique ou avec des glycosaminoglycanes chargés négativement et induire l'absorption par endocytose du complexe de transfection. Enfin, l’agent de transfection devrait améliorer l'échappement de l'endosome et le dépaquetage des acides nucléiques à partir du complexe. Les peptides amphiphiles et cationiques, qui ont la capacité de pénétrer dans les cellules, possèdent toutes les caractéristiques ci-dessus nommées. En effet, ils s’associent aux acides nucléiques via des liaisons électrostatiques, ils se lient de manière efficace et traversent la membrane plasmique en favorisant l'absorption de la cargaison. LAH4-L1 est le peptide de la famille LAH4 riche en lysines et histidines, possédant une activité de transfection d’ADN et de pARNi prometteuse. Ce qui a été montré dans des expériences biologiques sur des cellules en culture. Le peptide LAH4-L1 présente des modes d'interaction différents avec les membranes à pH neutre et acide, ce qui est l'une des caractéristiques les plus importantes puisqu’elle assure une libération efficace des acides nucléiques dans le cytoplasme. Ce travail est dédié à l'étude des caractéristiques structurales et thermodynamiques de l'association LAH4-L1 avec des membranes modèles et des acides nucléiques, comme l'ADN générique et de pARNi. Une grande variété de techniques biophysiques, telles que la résonance magnétique nucléaire, le dichroïsme circulaire, la calorimétrie de titration isotherme, la diffusion dynamique de la lumière et le dosage d'efflux de la calcéine, a été utilisée pour élucider le mécanisme de la transfection cellulaire efficace par le peptide LAH4-L1.


  • Résumé

    Gene and RNA-based therapies have a great promise as the methods for the treatment of variety of the genetic disorders and viral infections, but also it is a versatile tool for the investigation of the genetic and epigenetic mechanisms underlying the proper functioning or dysfunctioning of the cells and complex organisms. However, intracellular delivery of nucleic acids remains a major hurdle for the implementation of these therapies. In spite of the recent progress in the field, there is limited number of the non-viral transfection agents that passed to the clinical phase of the drug development.An efficient transfection agent forms a complex (usually non-covalent) with nucleic acids, which is stable in the extracellular environment, in particular in the blood plasma. Furthermore, it should promote the cellular delivery by interacting with the plasma membrane or negatively charged glycosaminoglycans and inducing the endocytic uptake of the transfection complex. Finally transfection agent should enhance the endosomal escape and unpacking of the nucleic acids from the complex.Cationic amphipathic cell-penetrating peptide comprise all above-named features as they associate electrostatically with the nucleic acids, they bind efficiently and translocate plasma membrane promoting the cargo uptake. LAH4-L1 is the lysine and histidine-rich designed peptide from LAH4 family, possessing a promising DNA and siRNA transfection activity, which was shown in biological experiments on the cell culture. LAH4-L1 peptide displays different modes of interaction with the membranes at neutral and acidic pH, which is one of the most important features that assure an efficient nucleic acid release to the cytoplasm.This works is dedicated to the investigation of structural and thermodynamic characteristics of the LAH4-L1 association with model membranes and nucleic acids, such as generic DNA and siRNA. The variety of the biophysical techniques, as nuclear magnetic resonance, circular dichroism, isothermal titration calorimetry, dynamic light scattering and calcein efflux assay, were used to unravel the mechanism of efficient cellular transfection by LAH4-L1 peptide.


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