Mise au point et évaluation d'une technique de PCR permettant la détection et le typage des entérovirus directement à partir de produits pathologiques ou d'échantillons environnementaux

par Wafa Ibrahim

Thèse de doctorat en Virologie

Sous la direction de Bruno Pozzetto.

Le président du jury était Olivier Garraud.

Le jury était composé de Bruno Pozzetto, Cécile Henquell, Didier Hober, Sylvie Pillet, Francis Delpeyroux.


  • Résumé

    Les entérovirus (EV) humains, membres de la famille des Picornaviridae, comprennent plus de 100 génotypes appartenant à 4 espèces : Enterovirus A, B, C et D. Ces virus sont à l’origine de pathologies très variées et occupent une place importante en santé publique. La méthode conventionnelle de typage des EV consiste en une réaction de séroneutralisation avec des antisérums spécifiques à partir de souches isolées en culture cellulaire ; cette technique est longue, coûteuse et limitée par sa capacité à identifier correctement les variants antigéniques et les nouveaux génotypes. De plus, elle est limitée aux génotypes cultivables. De nouvelles méthodologies de typage moléculaire par séquençage partiel du génome ont été récemment développées ; elles consistent à analyser une partie variable de la région codant une des protéines de capside (VP1 ou alternativement VP2 ou VP4). Cependant ces techniques sont le plus souvent réalisées à partir de souches isolées en culture cellulaire. Le but de ce travail a été de développer une technique de typage des EV directement sur des prélèvements cliniques en se basant sur le séquençage partiel de la région VP2 dont le laboratoire avait montré précédemment l’intérêt (Nasri et al., 2007). Pour le dessin des amorces, nous avons utilisé la stratégie CODEHOP (COnsensus DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) de manière à améliorer à la fois la spécificité et la sensibilité de la méthode d’amplification. Nous présentons ici un premier article décrivant la nouvelle technique de typage VP2 et rapportons son application au typage d’échantillons cliniques trouvés positifs par une PCR ciblant la région 5’ non codante du génome des EV sur une période de trois ans. Le deuxième article présente pour la première fois l’application d’une technique de typage direct à des échantillons environnementaux d’eaux usées. Le troisième article montre l’intérêt de coupler deux techniques de typage ciblant des régions différentes (VP1 et VP2) pour l’identification de souches d’EV isolées par culture cellulaire en Centre-Afrique. Malgré des problèmes de sensibilité, cette nouvelle technique de typage directement à partir d’échantillons peut rendre de grands services tant en clinique humaine que pour la surveillance environnementale

  • Titre traduit

    Development and evaluation of a PCR technique for detection and typing of enteroviruses directly from pathological product or environmental samples


  • Résumé

    Human enteroviruses (EV), members of the Picornaviridae family, comprise more than 100 genotypes belonging to four species: Enterovirus A, B, C and D. These viruses are responsible for a wide range of pathologies and play an important role in Public Health. The classic method for typing EVs consists in a seroneutralisation assay with specific antisera using strains isolated by cell culture; this technique is cumbersome, expensive and unable to type currently antigenic variants and new serotypes. In addition, it is limitated to culturable serotypes. New methods of molecular typing by partial sequencing of the genome have been recently developed; they consist in analysing a variable part of the region coding for capsid protein (VP1 or alternatively VP2 or VP4). However, these techniques are usually performed on strains isolated by cell culture. The aim of this work was to develop a typing method able to work from clinical specimens by partial sequencing of the VP2 region, which had been shown to exhibit a good typing performance (Nasri et al., 2007). For the design of primers, we used the CODEHOP (COnsensus DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) strategy on order to improve the sensitivity and the specificity of the amplification assay. We present herein a first article that describes in details the new VP2 typing method and requests its use for typing clinical specimens found positive by a PCR assay targeting the 5’ non coding region of EVs over a period of three years. The second paper describes for the first time the direct use of a typing method on environtmental wastewater samples. The third article shows the interest of coupling 2 typing techniques targeting different regions (VP1 and VP2) of the EV genome for the identification of strains isolated by cell culture in Republic of Central Africa. Despite a loss of sensitivity, the new VP2 typing method used directly on specimens was found to be of great help both for human diagnosis and environmental surveillance


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