Transcriptomic and functional analysis of genes encoding pan-neuronal RNA binding proteins in Drosophila

par Xia Sun

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Marie-Laure Samson.

Le président du jury était Pierre Capy.

Le jury était composé de Marie-Laure Samson, Pierre Capy, Brian Oliver, Jean-Maurice Dura, Jean-René Martin, Serge Birman, XingJia Shen.

Les rapporteurs étaient Brian Oliver, Jean-Maurice Dura.

  • Titre traduit

    Analyse transcriptomique et fonctionelle de gènes de drosophile codant pour des protéines de liaison à l'arn exprimées dans les neurones


  • Résumé

    La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle essentiel dans le système nerveux, de l’assemblage à la fonction. Chez les métazoaires, la famille multigénique ELAV / Hu code pour des protéines de liaison à l'ARN produites dans les neurones et impliqués dans cette régulation. Le gène elav (embryonic lethal abnormal visual system) code pour une protéine essentielle produite dans tous les neurones et est présent seulement chez les diptères. L’élucidation des fonctions des plus anciens paralogues de drosophile, fne (found in neurons) et rbp9 (RNA binding protein 9), a fait l'objet de ce travail, à cause de (1) l’étroite relation de ces gènes avec les orthologues de vertébrés, (2) la disponibilité de mutants nuls viables.En collaboration avec le laboratoire de Brian Oliver, NIH, États-Unis, nous avons utilisé le RNA-Seq pour analyser le transcriptome de tête de mutants fne-. Les données ont été analysées ) avec les programmes Cuffdiff et DESeq pour identifier des différences dans les niveaux de transcripts mutants et ceux d’une souche sauvage de référence (WT). L'épissage alternatif a été examiné avec Spanki (SPlicing ANalysis Kit), un suite de programmes que nous avons contribué à développer. Spanki utilise les données de séquence des jonctions exon-exon et compare l’abondance de formes alternatives et mutuellement exclusives de transcrits issus d’un événement d'épissage. Les premières analyses se sont concentrées sur les différences de transcriptomes entre males et femelles sauvages. La détermination sexuelle somatique et le comportement chez la drosophile sont sous le contrôle d'une cascade génétique bien caractérisée et contrôlée par les gènes Sxl, tra, msl2, dsx et fru, mais les cibles en aval de cette voie canonique demeurent largement inconnues. Notre approche nous a permis d’identifier (et de valider par qPCR) de nouveaux gènes exprimés différemment dans les deux sexes. J’ai montré que l’un d’entre eux est le gène fne, que sa régulation est indépendante de tra et tra2, mais dépend de Sxl. Ces propriétés font de fne la première cible identifiée dans une voie alternative de détermination sexuelle prédite par le laboratoire de T. Cline sur la base d'autres études. J'ai aussi montré l’existence d'un rôle précédemment non documenté pour tra et tra2 dans la lignée somatique mâle. Afin d'identifier des réseaux fonctionnels contrôlés par fne, les données du transcriptome de mutants ont été comparées à celles de la souche sauvage de référence. Plusieurs gènes dont le niveau de transcrits ou l’épissage alternatif est altéré en absence du gène fne ont été identifiés et validés par qPCR. Par exemple, l'épissage alternatif de unc-13, essentiel pour l'exocytose des vésicules, est affecté dans les mutants fne. D'autres gènes impliqués dans les fonctions synaptiques ont été identifiés, y compris n-syb, tomosyn, brp et Clc. En outre, il existe des interactions génétiques entre la mutation fne et des mutations affectant les fonctions synaptiques. Ces interactions peuvent causer une létalité synthétique dans les doubles mutants. Finalement, les males mutants fne- ont un comportement de « chaining» également compatible avec une fonction à la synapse. Ainsi, le gène fne établit un lien entre la régulation post-transcriptionnelle, la fonction synaptique et le comportement.Dans la dernière partie de mon travail, j'ai utilisé une approche évolutive pour tenter de distinguer les fonctions spécifiques de fne ou de rbp9, des fonctions ancestrales. Des approches moléculaires, anatomiques et comportementales ont été employées. Les résultats distinguent différentes catégories de gènes, spécifiquement ceux dont l'expression est affectée (1) uniquement par fne (2) uniquement par rbp9 (3) à la fois par fne et rbp9 de manière redondante ou synergique. J’ai mis en évidence une redondance fonctionnelle partielle des deux gènes causant une létalité synthétique à l'âge adulte dans les doubles mutants, mais j’ai aussi identifié des fonctions spécifiques.


  • Résumé

    Post-transcriptional regulation plays pivotal roles from assembly to function of the nervous system. In metazoans, the ELAV/Hu genes constitute a conserved multigene family of pan-neuronal RNA-binding protein involved in post-transcriptional regulation. The elav (embryonic lethal abnormal visual system) gene is the first described family member, it encodes a vital protein and is restricted to dipterans. Elucidating the functions of the more ancient Drosophila paralogs, fne (found in neurons) and rbp9 (RNA-binding-protein-9), has been the focus of this work, because of (1) the close relationship of these genes to the vertebrate orthologs, (2) the availability of viable null mutants.In collaboration with the laboratory of Brian Oliver, NIH, USA, we used RNA-Seq to analyze the head transcriptomes of fne- mutants and a wild type reference strain (WT). The RNA-Seq data was searched for differences in transcript levels using the programs Cuffdiff and DESeq. Alternative splicing was examined using a suite of programs called Spanki (SPlicing ANalysis Kit), whose development we participated in. Spanki utilizes only sequence reads spanning exon-junctions to compare pairs of mutually exclusive alternative splicing events.Initial analyses included sex-specific comparisons in WT transcriptomes. Somatic sexual determination and behavior in Drosophila are under the control of a well characterized genetic cascade initiated by Sxl (Sex lethal), but the targets downstream of this canonical pathway remain largely unknown. As expected, the genes Sxl, tra (transformer), msl2 (male-specific lethal gene), dsx (doublesex) and fru (fruitless), which belong to the canonical sex-determination/dosage compensation pathways were identified by our analyses. In addition, new genes whose transcript expression levels differ between the sexes were identified and validated by qPCR. Further, I obtained evidence for previously undocumented roles of tra and tra2 (transformer 2) in the male soma. Finally, a sex-biased alternative splicing event was identified in fne, whose regulation is independent of tra or tra2, but dependent upon Sxl. This makes of fne the first Sxl-dependent, tra/tra2-independent target identified in a sex determination/differentiation pathway, previously been predicted to exist based upon other studies.The data was analyzed to identify functional networks controlled by fne. I found that it affects the expression of several genes at the level of transcript expression and alternative splicing involved in synaptic functions. They include of unc-13, n-syb (neuronal Synaptobrevin), tomosyn, brp (bruchpilot) and Clc (Clathrin light chain). Further, genetic interactions between fne and shi (shibire) or nrg (neuroglian), which also possess synaptic functions, reveal synthetic lethality in the double mutants. In addition, fne mutant males display a fruitless-like chaining behavior, also consistent with a function at the synapse. Thus the fne gene links post-transcriptional regulation to synaptic function and behavior.Finally, I used an evolutionary approach to distinguish newly evolved functions, i.e. specific to fne or rbp9, from those that are shared and thus more likely to be ancestral. Molecular, anatomical and behavioral approaches in parallel analyses of fne and rbp9, show that they possess both gene-specific and overlapping functions. The latter is evident from synthetic lethality in early adulthood of double mutants. My results distinguish different gene categories with respect to their regulation: genes whose expression is affected (1) only by fne (2) only by rbp9 (3) both by fne and rbp9 in redundant or synergistic ways. Finally, I showed that male-male interactions dramatically differ between fne versus rbp9 mutants, revealing the emergence of a new (or loss of an ancestral) function in behavior.


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