Etude fonctionnelle des formes oncogéniques de KIT : nouvelles stratégies d'inactivation de la signalisation oncogénique KIT

par Marianne Le Gall

Thèse de doctorat en Science du vivant – Médecine – Santé

Sous la direction de Marie-Alix Poul.

Soutenue le 29-04-2014

à Paris 11 , dans le cadre de Ecole doctorale Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé (2000-2015 ; Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne) , en partenariat avec Institut de Recherche en Cancérologie (Montpellier) , Laboratoire de biologie et pharmacologie appliquée (Cachan, Val de Marne) (laboratoire) et de Laboratoire de Biotechnologie et Pharmacologie génétique Appliquée (laboratoire) .

Le président du jury était Michel Arock.

Le jury était composé de Marie-Alix Poul, Michel Arock, Josée Golay, Olivier Kosmider, Guillaume Cartron, Patrick Chames.

Les rapporteurs étaient Josée Golay, Olivier Kosmider.


  • Résumé

    Lorsqu’il est surexprimé ou activé constitutivement par mutation, le récepteur tyrosine kinase KIT est impliqué dans le développement de pathologies prolifératives comme les mastocytoses, les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) et certaines leucémies. La voie de signalisation KIT représente donc une cible thérapeutique majeure en oncologie. Le développement d’une nouvelle classe de molécules pharmacologiques appelées inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) est en plein essor. Un exemple majeur d’ITK est l’imatinib qui cible, entre autre, KIT et est efficace dans la plupart des GIST. Cependant, le traitement aux ITK est souvent confronté au phénomène de résistance primaire ou acquise par mutation secondaire. C’est pourquoi nous cherchons à développer de nouveaux composés ciblant KIT ou les voies de transductions activées par ses formes oncogéniques, et ce par 3 approches.Nous avons récemment montré que les mutants oncogéniques de KIT ont une localisation intracellulaire alors que KIT sauvage est exprimé à la membrane. L’inhibition de l’activité kinase des mutants restaure une localisation normale. A partir de cette observation, nous avons créé et validé un test de criblage par cytométrie mesurant la relocalisation de KIT muté à la surface cellulaire. Le criblage d’une chimiothèque nous a permis de sélectionner de nouveaux inhibiteurs de la signalisation KIT actifs sur des lignées cellulaires mutées pour KIT.Nous avons utilisé la technique du phage display pour sélectionner des anticorps au format scFv et VHH spécifiques de la partie intracellulaire de KIT mutant. Lors de leur expression dans le cytosol (on parle alors d’intrabodies), leur fixation au niveau de KIT inhibe soit directement l’activité kinase, soit le recrutement de partenaires de signalisation. Nous avons obtenu des intrabodies de différentes spécificités vis-à-vis des formes de KIT dont la caractérisation fonctionnelle est en cours Les intrabodies inhibiteurs seront utilisés pour cribler des chimiothèques par ELISA. Les molécules chimiques recherchées empêcheront la fixation des intrabodies sur la région intracellulaire de KIT. On sélectionnera donc des molécules inhibant potentiellement l’oncogénicité de KIT.Nous avons développé des anticorps au format scFv-Fc par phage display qui reconnaissent le domaine extracellulaire de KIT. Deux des anticorps sélectionnés inhibent donc la signalisation induite par le SCF. Dans des lignées de leucémie exprimant KIT WT, nous avons montré que l’utilisation de ces anticorps entraîne une diminution de la viabilité cellulaire. De plus, ils diminuent également la prolifération de lignées de leucémie à mastocytes sensibles et résistantes à l’imatinib (HMC11 et HMC12, respectivement). Ils représentent donc des outils thérapeutiques potentiels pour le traitement des pathologies impliquant KIT ainsi que pour contourner la résistance aux ITK de certains mutants.

  • Titre traduit

    Functional study of oncogenic KIT : new strategies for selective oncogenic KIT-signaling inactivation


  • Résumé

    When overexpressed or constitutively active by mutation, the tyrosine kinase receptor KIT is involved in some proliferative diseases such as gastro-intestinal stromal tumors (GIST), mastocytosis and some leukemia. Therefore, KIT signaling represents a major target in oncology. Development of a new therapeutic class called tyrosine kinase inhibitors is in full expansion. A major example of TKI is imatinib which targets KIT and is efficient in the majority of GIST cases. However, TKI treatment is often unpaired by primary or acquired resistance due to secondary mutations. That is why we aim to develop new compounds to target KIT or associated signaling pathways by three strategies.We have recently shown that oncogenic KIT mutants are intracellularely localized whereas WT KIT is expressed at the cell surface. Kinase activity inhibition leads to membrane mutants’ relocalization. Based on this finding, we developed and validated a screening assay measuring mutants’ relocalization by cytometry. Chemicals library screening allows us to select new KIT signaling inhibitors active on KIT mutant cell lines.We used phage display to generate scFv and VHH antibodies which are specific to KIT intracellular domain. When expressed in cytoplasm (they are called intrabodies), their binding on KIT inhibits kinase activity directly or signaling partners’ recruitment. Selected intrabodies are specific to various KIT isoforms and their functional characterization is ongoing. KIT inhibitory intrabodies will be used to screen chemical libraries by ELISA for drugs that block intrabodies binding on KIT intracellular domain. We will then select molecules that potentially inhibit KIT oncogenicity.We developed scFv-Fc antibodies by phage display that recognize KIT extracellular domain. Two selected antibodies inhibit SCF induced signaling. In WT KIT expressing leukemic cell lines, we showed that antibody treatment reduces cell viability. Moreover, they also diminish cell proliferation of 2 imatinib sensitive and resistant mast cell leukemia cell lines (HMC1.1 and HMC1.2, respectively). They represent potential therapeutic tools for treatment of KIT involved diseases and for bypass TKI resistance of some mutants.


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