Réponses post-réplicatives au stress réplicatif chronique faible ou endogène, chez les mammifères

par Indiana Magdalou

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Bernard Lopez.


  • Résumé

    La réplication de l’ADN est un phénomène physiologique essentiel à la transmission du patrimoine génétique mais est aussi une source importante de stress endogène. Le stress réplicatif peut conduire à une instabilité génomique et a été mis en évidence à une étape très précoce du développement tumoral et de la sénescence. La recombinaison homologue (RH) est un processus de réparation qui permet la prise en prise en charge du stress réplicatif. De ce fait, un défaut de RH devrait permettre de révéler les stress réplicatifs endogènes. Ainsi, une progression ralentie des fourches de réplication a été observée dans des cellules déficientes pour la RH (RH-), et ce en absence de tout traitement exogène (Daboussi 2008). De plus, de nombreux travaux ont mis en évidence la présence de défauts mitotiques dans les cellules RH-, en absence de tout traitement exogène (Griffin 2000; Kraakman-van der Zwet 2002; Bertrand 2003; Daboussi 2005; Laulier 2011; Rodrigue 2013). L’origine de ces défauts mitotiques spontanés reste peu claire. En effet, la RH étant un processus préférentiellement actif au cours des phases S et G2, le lien avec la mitose reste à éclaircir. Cette thèse a pour but de comprendre l’impact du stress réplicatif très faible ou endogène sur les phases post-réplicatives du cycle cellulaire. Dans un premier temps, je me suis intéressée à l’impact de ce stress sur la mitose. Les résultats obtenus montrent que le traitement des cellules contrôle à de très faibles doses d’hydroxyurée (HU) n’affecte pas la progression dans le cycle cellulaire mais induit cependant une diminution de la vitesse de réplication, comparable à celle observée dans les cellules RH-. De plus le traitement des cellules contrôle à des faibles doses d’HU induit l’apparition de défauts mitotiques, notamment des centrosomes surnuméraires, à la même fréquence que dans les cellules RH- non traitées. Inversement, l’ajout de précurseurs de nucléotides dans les cellules RH- permet de supprimer la diminution de la vitesse de réplication ainsi que les centrosomes mitotiques surnuméraires. Ainsi, un stress réplicatif subtil, qui n’impacte pas de façon détectable la progression dans les phases S et G2 du cycle cellulaire, ni l’entrée en mitose, cause cependant des défauts mitotiques sévères. De façon importante, les centrosomes mitotiques surnuméraires peuvent entrainer des mitoses multipolaires, impactant ainsi l’ensemble du génome. Ces données mettent en évidence la connexion qui existe entre la réplication des chromosomes et leur ségrégation. Dans un second temps, j’ai étudié l’impact du stress réplicatif faible ou endogène en phase G2. Cette étude a été réalisée en utilisant des cellules RH-, ainsi qu’un modèle d’induction de faible stress réplicatif après traitement à très faible dose d’HU. La présence de foyers pRPA-Ser33 en phase G2 a été observée dans ces deux modèles, mettant en évidence des zones de stress réplicatif. Après traitement à très faible dose d’HU, nous observons également la présence en phase G2 de foyers 53BP1 et RAD51 qui colocalisent partiellement avec les foyers pRPA-Ser33. L’analyse en spectrométrie de masse après co-immunoprécipitation de la protéine 53BP1 en phase G2 a permis d’établir un lien avec des protéines impliquées dans le contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique ainsi que dans le points de contrôle mitotique, étayant ainsi le lien entre le stress réplicatif et les défauts mitotiques. Pour finir, l’immunoprécipitation de la chromatine liée à la protéine pRPA-Ser33 en phase G2, suivie d’un séquençage (ChIPseq), a permis de révéler l’absence d’enrichissement au niveau des sites fragiles communs et de mettre en évidence un enrichissement au niveau des régions promotrices de certains gènes, notamment de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et de la mort cellulaire. Ces résultats soulignent le lien entre le stress réplicatif très faible ou endogène et l’instabilité chromosomique, qui peut mener à l’initiation tumorale.

  • Titre traduit

    Post-S phase responses to chronic low or endogenous replicative stress, in mammalian cells


  • Résumé

    DNA replication is a physiological process, essential for genetic information transmission but DNA replication is also an important source of endogenous stress. Replicative stress can lead to genomic instability and has been reported in early-stage malignancies and senescence. Homologous recombination is a repair process which can handle replicative stress. Therefore, a defect in homologous recombination could reveal endogenous replicative stresses. Consistently, a slow down in replication fork progression has been observed in homologous recombination deficient (HR-) cells, in absence of any exogenous treatment (Daboussi et al. 2008). In addition, several studies have shown the presence of mitotic defects in HR- cells, in absence of any exogenous treatment (Griffin 2000; Kraakman-van der Zwet 2002; Bertrand 2003; Daboussi 2005; Laulier et al. 2011; Rodrigue 2013). The origin of these spontaneous mitotic defects is still unclear. Indeed, homologous recombination is preferentially active in S and G2 phases thus, the link with mitosis remains to be elucidated. The aim of this thesis is to understand the impact of a low or endogenous replicative stress on post-replicative phases. First, I studied the impact of a low or endogenous replicative stress on mitosis. Control cells were treated with very low hydroxyurea doses, that did not affected cell cycle progression but did slow down the replication fork progression to the same level than unchallenged HR- cells. Importanntly, exposure of the control cells to these low hydroxyurea doses generated the same mitotic defects, notably extra centrosomes, and to the same extent than in untreated HR- cells. Reciprocally, supplying nucleotide precursors to HR- cells suppressed both their replication deceleration and mitotic extra centrosome phenotypes. Therefore, subtle replication stress that does not impact S and G2 phase progression nor the entry in mitosis, nevertheless causes severe mitotic defects. Importantly, mitotic extra centrosome can lead to multipolar mitosis and then impact the whole genome stability. These data highlight the crosstalk between chromosome replication and segregation. Secondly, I studied the impact of low or endogenous replicative stress on G2 phase. This study was done using HR- cells as well as control cells treated with very low HU doses to induce a very low replicative stress. In both of these models, the presence of pRPA-Ser33 foci was observed in G2 phase, highlighting replicative stress regions. After very low HU treatement, we observed 53BP1 and RAD51 foci in G2 phase. These foci partially colocalized with pRPA-Ser33 foci in G2 phase. Mass spectrometry analyse after 53BP1 coimmunoprecipitation allowed to etablish a link between proteins involved in mitotic spindle assembly control and in mitotic checkpoint. These data support the link between replicative stress and mitotic defects. Lastly, the immmunoprecipitation of the chromatin interacting with pRPA-Ser33 in G2 phase, followed by sequencing (ChIPseq) allowed to reveal the absence of common fragile site enrichment and to highlight an enrichment at promoter regions of genes involved in cell cycle and cell death regulation. These data underline the link between very low or endogenous replicative stress and chromosomal instability, which can lead to tumorigenesis.


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