Role of Nrd1p and Ctk1p in transcription termination and the metabolism of non-coding RNAs in Saccharomyces cerevisiae

par Agnieszka Tudek

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire

Sous la direction de Domenico Libri.

Soutenue le 21-03-2014

à Paris 11 , dans le cadre de École doctorale Gènes, Génomes, Cellules (2010-2015 ; Gif-sur-Yvette, Essonne) , en partenariat avec Centre de génétique moléculaire (Gif-sur-Yvette, Essonne) (laboratoire) et de Métabolisme et fonction de l'ARN dans le noyau (équipe de recherche) .

Le président du jury était Herman Van Tilbeurgh.

Le jury était composé de Domenico Libri, Herman Van Tilbeurgh, Antonin Morillon, Françoise Stutz, Denis Lafontaine, Olivier Namy.

Les rapporteurs étaient Antonin Morillon, Françoise Stutz.

  • Titre traduit

    Le rôle de Nrd1p et Ctk1p dans la terminaison de la transcription et le métabolisme des ARNs non-codant chez Saccharomyces cerevisiae


  • Résumé

    L’ARN polymérase II (ARNPII) synthétise des ARNs codants et des ARNs non-codants (ARNnc) tels que les petits ARNs nucléaire/nucléolaire (sn/snoRNAs) et les CUTs (Cryptic Unstable Transcripts). Les CUTs sont des transcrits ubiquitaire souvent produits dans des régions codants dont la transcription peut interférer avec l’expression des gènes. Le contrôle de l’expression des ARNnc est essentiel et se fait aux niveaux de la terminaison de la transcription et la dégradation de l’ARN. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae la terminaison de la transcription des gènes codants est effectuée par le Facteur de Clivage et de Polyadénylation (CPF), tandis que les ARNnc courts sont terminés par le complexe Nrd1p-Nab3p-Sen1p (NNS). La terminaison de la transcription est régulée par la phosphorylation du domaine C-terminal (CTD) de l’ARNPII composé de répétitions du motif Y1S2P3T4S5P6S7. Un niveau élevé de phosphorylation des résidus Ser5 près du promoteur permet l’activité du complexe NNS. La phosphorylation des résidus Ser2 est catalysée durant la transcription par la kinase Ctk1p et ces résidus sont reconnus par des éléments de la voie CPF. Mon travail de thèse a porté sur le mécanisme de terminaison de la transcription par le complexe NNS. La terminaison NNS dépend de la liaison de Nrd1p et Nab3p à des motifs dans l’ARN naissant et l’activité hélicase de Sen1p qui provoque le relarguage de la polymérase. La sous-unité Nrd1p interagit avec le domaine CTD de l’ARNPII phosphorylé sur Ser5 à travers son domaine CID (CTD-interaction domain). Le rôle du CID dans la terminaison à été proposé mais pas encore clairement démontré. En collaboration avec le groupe de P. Cramer (Université Louis-et-Maximilien de Munich Allemagne) nous avons mis en évidence que le CID est requis pour une terminaison efficace par la voie NNS et qu’il est important pour le recrutement de Nrd1p sur l’ARNPII. Le CID est aussi impliqué de manière directe ou indirecte dans l’interaction de Sen1p avec Nrd1p et Nab3p. En parallèle, avec le groupe de F. Holstege (Université Centre Médicale de Utrecht, Pays-Bas) nous avons montré que la phosphorylation en Ser2 du domaine CTD est requise pour une terminaison efficace par la voie NNS. De manière surprenante, ce résidu joue un rôle mineur dans la terminaison des ARNs codants effectuée par le complexe CPF. Les ARNs naissant terminés par le complexe NNS sont rapidement ciblés par le complexe nucléase exosome/Rrp6p et son cofacteur TRAMP ce qui mène a la maturation des sn/snoRNAs et la destruction des CUTs. Le complexe NNS interagit in vivo avec l’exosome et le complexe TRAMP, ce qui facilite la dégradation. Cependant les détails moléculaires de cette interaction restent inconnus. Nous avons montré que le domaine CID est requis et suffisant in vivo et in vitro pour l’interaction de Nrd1p avec la partie C-terminale de la sous-unité Trf4p du complexe TRAMP, que nous avons appelé NIM (Nrd1p-Interaction Motif). En collaboration avec le groupe de R. Stefl (Université Masaryk, République Tchèque) nous avons étudié par spectroscopie RMN la structure de ce motif NIM lié au CID. Nous avons mis en évidence que le CID lie le NIM et le CTD de façon similaire, et que ces interactions sont mutuellement exclusives. Le NIM se lie au CID environ 100 fois plus fortement qu’au CTD. Nous proposons que ces interactions alternatives de Nrd1p définissent des formes différentes du complexe NNS, une qui fonctionne dans la terminaison de la transcription, l’autre qui est active dans la dégradation. In vitro l’interaction du NIM avec le CID stimule l’activité poly(A)-polymérase de Trf4p ce qui suggère une fonction importante de cette interaction dans la dégradation. Nous montrons aussi que Rrp6p interagit directement avec Trf4p et cette liaison in vivo sert à recruter le complexe TRAMP à l’exosome Nous proposons que ce jeu serré d’interactions entre les complexes NNS, TRAMP et l’exosome/Rrp6p contribue à augmenter l’efficacité de dégradation de l’ARN in vivo


  • Résumé

    The RNA polymerase II (RNAPII) synthesizes protein-coding RNAs and many non-coding RNAs (ncRNAs) such as small nuclear/nucleolar (sn-/snoRNAs) and Cryptic Unstable Transcripts (CUTs). CUTs are ubiquitously transcribed including overlapping and antisense to genes, which can interfere with gene expression. Control of ncRNA expression is vital and also operates at the level of transcription termination and RNA degradation.In yeast Saccharomyces cerevisiae transcription of protein-coding genes is terminated by the Cleavage and Polyadenylation Factor (CPF), while short ncRNAs are generated by transcription termination dependent from the Nrd1p-Nab3p-Sen1p (NNS) complex. Transcription termination is regulated by phosphorylation of the carboxy-terminal domain (CTD) of the Rpb1p subunit of RNAPII, composed of repeats of the Y1S2P3T4S5P6S7 motif. Promoter-proximal high levels of serine 5 phosphorylated (Ser5P) CTD favors the function of the NNS pathway while the Ser2 phosphorylated mark (Ser2P), which is gradually introduced during transcription by Ctk1p, is recognized by components of the CPF pathway. The study of the mechanism of action of the NNS complex was the subject of my PhD work.NNS-dependent transcription termination is driven by the recognition of four nucleotide motifs in the nascent RNA by Nrd1p and Nab3p and the release of the RNAPII by the Sen1p helicase. Nrd1p interacts with the CTD-Ser5P via its CTD-interaction domain (CID). Thus a role of the CID in termination was anticipated but not demonstrated. In collaboration with the group of P. Cramer (Ludwig Maximilian University of Munich, Germany), we have shown that the Nrd1p CID domain is required for efficient transcription termination at most NNS-target genes and that it is important for the recruitment of Nrd1p to the RNAPII. This domain is also involved, directly or indirectly, in the interaction of the Sen1p helicase with Nrd1p and Nab3p. In the second project, in collaboration with F. Holstege group (University Medical Center Utrecht, Netherlands), we have shown that the CTD-Ser2P mark is important for efficient transcription termination by the NNS pathway but, surprisingly, it appears to play a minor role in termination of mRNA-coding genes by the CPF-complex.Shortly after NNS-dependent termination, the released ncRNAs are targeted by the nuclear exosome/Rrp6p nuclease complex and its cofactor the TRAMP which results in trimming of sn-/snoRNAs to a mature form and complete degradation of CUTs. The NNS complex co-purifies in vivo with the TRAMP/exosome, which is believed to facilitate subsequent degradation and processing. However, the molecular details of this interaction are unknown. We show that the CID is required and sufficient in vivo and in vitro for the interaction of Nrd1p with a motif present in the C-terminal region of Trf4p, which we called NIM (for Nrd1p-Interaction Motif). In collaboration with the group of R. Stefl (Masaryk University, Czech Republic), we obtained the NMR structure of the CID bound to the NIM and demonstrated that the CID binds in a similar manner to the CTD and the NIM. The CID interacts with the CTD and the NIM in a mutually exclusive manner and the former interaction is roughly 100 times stronger than the first. We propose that these alternative interactions represent two forms of the NNS complex, one functioning in termination and the other in degradation. Importantly, the NIM-CID interaction is likely to be functionally relevant since in vitro it results in the stimulation of the polyA polymerase activity of the Trf4p. We further show that Trf4p interacts directly with Rrp6p, which in vivo serves to recruit the TRAMP to the core exosome complex. This tight interplay between the NNS, TRAMP and exosome/Rrp6p complexes most likely accounts for the efficiency of RNA degradation in vivo.


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