Caractérisation fonctionnelle de la MAP kinase MPK10 de Leishmania

par Mathieu Cayla

Thèse de doctorat en [Microbiologie procaryote et eucaryote]

Sous la direction de Gerald Späth.


  • Résumé

    Les protozoaires pathogènes du genre Leishmania ont développé des mécanismes uniques de signalisation leur permettant de détecter des changements dans leur environnement. Ces changements vont permettre leur différenciation, étape essentielle pour assurer leur survie et leur croissance dans la cellule de l'hôte mammifère. Peu de choses sont connues sur les mécanismes mis en jeu lors de la différenciation, mis à part le rôle essentiel joué par les MAP kinases (MAPKs) et la phosphorylation des protéines. Mes travaux de thèse ont permis i) de mettre en évidence les mécanismes de régulation de MPK10 chez Leishmania, qui sont très inhabituels pour une MAPK, et ii) d'identifier un rôle potentiel de cette kinase dans la réponse à un appauvrissement du milieu en nutriments ou dans les étapes de différenciation des promastigotes en amastigotes axéniques. Les MAPKs sont activées par phosphorylation simultanée, par des MAPK kinases, des résidus tyrosine et thréonine du motif conservé TxY de la boucle d'activation, en réponse, par exemple, aux variations de conditions environnementales. En utilisant une approche transgénique j'ai observé i) une augmentation hautement régulée de la quantité et de l'activité de MPK10, durant la différenciation des promastigotes en amastigotes axéniques. En effet, l'activité de cette kinase doit être inhibée après les 48 premières heures de différenciation pour permettre la survie et la prolifération des amastigotes axéniques ; ii) que l'activation de cette protéine n'était pas corrélée avec l'état de phosphorylation de la tyrosine du motif TxY, qui est en grande partie constitutive malgré son rôle essentiel dans l'activité de la kinase. La régulation de l'activité de MPK10 semble dépendre du domaine C-terminal. En effet, la suppression des derniers 46 acides aminés de MPK10 entraîne une augmentation de son activité, révélant ainsi le rôle du domaine C-terminal dans l'auto-inhibition de la kinase. J'ai également identifié une sérine à la position 395 dans ce domaine C-terminal, dont la phosphorylation/déphosphorylation pourrait être impliquée dans la régulation de MPK10. L'ensemble de ces résultats suggère que MPK10 est maintenue dans un état partiellement ou pré- activée et auto-inhibée par son domaine C-terminal. Ce type de régulation est unique pour une MAPK et nous conduit à l'hypothèse que MPK10 pourrait représenter un interrupteur permettant une réponse rapide des parasites à des variations environnementales. En utilisant une approche complémentaire basée sur la génération d'un mutant délété des allèles endogènes codant pour MPK10, j'ai montré que l'élimination de cette protéine ne semblait pas avoir de conséquences sur la viabilité et la croissance des promastigotes en condition de culture normale. En revanche, l'absence de MPK10 semble avoir d'importantes conséquences sur la viabilité des promastigotes lorsque ceux-ci sont cultivés dans un milieu pauvre en nutriments. J'ai effectivement montré une corrélation positive entre la quantité de MPK10 et la viabilité, car une diminution de la quantité de cette kinase entraîne une augmentation de la mortalité cellulaire lors de la culture des promastigotes dans ce milieu pauvre. Toutes ces données indiquent que MPK10 présente un mode de régulation très inhabituel et original comparé à la régulation des autres MAPKs eucaryotes, tels qu'une conformation pré-activée intrinsèque, et une régulation par auto-inhibition. De plus, MPK10 pourrait être impliquée dans la détection des nutriments du milieu environnant.

  • Titre traduit

    Functional characterisation of the Leishmania MAP kinase MPK10


  • Résumé

    Only little is known on the Leishmania-specific protein kinase biology that underlies development of the disease-causing amastigote stage. In this thesis, I unravel highly unusual regulatory mechanisms for the conserved Leishmania MAP kinase homolog MPK10, and implicate this kinase in response to environmental signals known to trigger axenic amastigote differentiation. Using a transgenic approach, I demonstrated a transitory, stage-specific increase in MPK10 activity during the promastigote to axenic amastigote conversion, which did not correlate with the largely constitutive phosphorylation status of the regulatory tyrosine residue inside the kinase activation loop, despite its major role for kinas activity. The deletion of the last 46 amino acids of MPK10 resulted in significantly enhanced kinase activity in MPK10, thus revealing its regulation by an auto-inhibitory mechanism. This suggests that MPK10 is maintained in a partially activated state and controlled by auto-inhibition, which itself is likely regulated by a phospho-serine residue inside the C terminal domain at position 395. Using a complementary approach based on a facilitated gene knock out strategy, I unraveled a non-essential role of MPK10 for the promastigote and amastigote stages, but essential functions in response to nutriment starvation. Together my data uncover highly unusual and novel aspects of parasite-specific protein kinase regulation, and propose MPK10 as a potential signal sensor of the mammalian host environment, whose intrinsic pre-activated conformation is regulated by auto-inhibition.

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Informations

  • Détails : 1 vol.(258 p.)
  • Annexes : 253 réf.

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  • Consultable sur place dans l'établissement demandeur
  • Cote : TS (2014) 252
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