Studies on the Primary Mechanisms of (6-4) photolyase : Photoactivation and DNA Repair

par Paul Ryan Martin

Thèse de doctorat en Chimie physique et chimie analytique

Sous la direction de Pascal Plaza.

Soutenue le 15-12-2014

à Paris 6 , dans le cadre de École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris) , en partenariat avec École normale supérieure - Paris (laboratoire) .

Le jury était composé de Thomas Gustavsson, Marten Vos, Lahouari Krim.

  • Titre traduit

    Etudes sur les mécanismes primaires de la photolyase (6-4) : photoactivation et photoréparation de l'ADN


  • Résumé

    Ce travail concerne les mécanismes photoinduits d’une flavoprotéine appartenant à la famille des cryptochromes et photolyases (CPF) : la photolyase (6-4). En utilisant de la lumière bleue cette protéine répare un dommage de l’ADN induit par les UV, le photoproduit (6-4). Nous avons étudié cette photoreparation ainsi qu’une autre réaction photoactivée que la photolyase utilise pour réduire son cofacteur flavine, la photoactivation. Nous avons faits nos études en utilisant la photolyase (6-4) de Xenopus laevis. Nous avons étudié la photoréduction du chromophore FADox de l’enzyme par spectroscopie d’absorption transitoire femtoseconde polarisée. Nous avons observé un transfert d’électron ultrarapide (~400 fs) après excitation du chromophore FADox. Nous avons caractérisés un résidu tryptophane comme réducteur. Nous avons cherché de distinguer entre les différents tryptophanes présents dans le site de photoactivation par des mesures d’anisotropie. Les résultats obtenus suggèrent que le mécanisme de transfert d’électron dans la photolyase n’est pas compatible avec le mécanisme supposé chez les photolyases qui consiste des transferts d’électron de long d’une chaine de trois résidus tryptophane. Grâce à des trains d’impulsions courtes, nous avons démontré que la photolyase (6-4) répare l’ADN par un mécanisme à deux photons successif. Le premier photon sert à convertir le défaut (6-4) en un intermédiaire métastable, X, qui a une durée de vie de ~2 min. Un second photon absorbé pendant cette durée de vie permet d’achever le cycle de réparation.


  • Résumé

    We studied the light-induced reactions of the (6-4) photolyase, a flavoenzyme of the cryptochrome/photolyase family that repairs the UV-induced (6-4) photodamage in DNA with the aid of blue light. We studied this photorepair reaction as well as the light-induced cofactor reduction called photoactivation that the enzyme uses to bring itself to a repair-active state in the (6-4) photolyase from Xenopus laevis. We have studied the photoactivation of the FADox cofactor of the enzyme using femtosecond polarised transient absorption spectroscopy. We observed a sub-picosecond electron transfer (~400 fs) after excitation of the FADox cofactor. We were able to characterise a tryptophan residue as the electron donor. We sought to differentiate the spectroscopically identical but differently oriented tryptophan residues within the protein’s photoactivation site by transient anisotropy measurements. Our results suggest that the photoactivation mechanism is not fully compatible with the mechanism thought to be conserved among photolyases: an electron transfer mechanism via electron hopping along a chain of three highly conserved tryptophan residues.Using series of single turnover flashes, we have found that the repair reaction proceeds by a successive two-photon mechanism. The first photon converts the (6-4) lesion into a metastable intermediate X, the lifetime of which is ~2 min. Absorption of a second photon within the lifetime of X results to the restoration of intact nucleobases. In light of our findings, the reaction was also studied by femtosecond transient absorption spectroscopy.

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