Bactéries associées à l'éponge Méditerranéenne Crambe crambe : diversité et possible rôle dans la biosynthèse des alcaloïdes guanidiniques

par Julie Croué

Thèse de doctorat en Microbiologie marine

Sous la direction de Marcelino Suzuki et de Nataly Bontemps.

Soutenue le 18-09-2014

à Paris 6 , dans le cadre de École doctorale Diversité du vivant (Paris) .

Le jury était composé de Marie-Lise Bourguet, Thierry Pérez, Sophie Tomasi, Olivier Thomas, François Lallier.


  • Résumé

    Crambe crambe (Schmidt, 1862), espèce largement retrouvée en Méditerranée, est la source de nombreuxalcaloïdes guanidiniques (crambescines et crambescidines). Les voies de biosynthèse de ces métabolitessecondaires n’ont pas encore été démontrées. Il a cependant été proposé que les crambescidines seraientproduites à partir de polycétides, suggérant ainsi la possible implication de micro-organismes dans leurbiosynthèse. Cependant les quelques études portant sur la présence ou non de bactéries associées à cette épongesont contradictoires. Durant cette thèse, nous avons caractérisé la communauté bactérienne associée à C. crambepar l’utilisation de techniques à la fois moléculaires et microscopiques, mettant en évidence l’associationspécifique entre une bêtaprotéobactérie et cette éponge méditerranéenne. La présence d’un micro-organismespécifique au sein du mésohyle de l’éponge pose alors la question du rôle de ce dernier au sein de son hôte etplus particulièrement sa possible implication dans la synthèse des alcaloïdes guanidiniques. L’étude de ladiversité microbienne cultivable par la mise en place d’une procédure d’acclimatation et la conception de diversmilieux de cultures, a permis l’isolement de micro-organismes minoritairement associés à C. crambe, mais n’acependant pas conduit à l’isolement de la bêtaprotéobactérie spécifique. La comparaison des empreinteschimiques (CLHP/DAD/ELSD – CLHP/ESIMS) des extraits de l’éponge et des bactéries cultivées, a révélé queces micro-organismes minoritaires n’étaient pas à eux seuls producteurs de ces métabolites bioactifs. La bactériemajoritaire, principale candidate dans la synthèse des métabolites n’étant pas cultivable, nous avons développédeux études complémentaires afin d’apporter des éléments de réflexion quant à sa possible implication. Laculture ex situ de colonies C. crambe accompagnée d’un stress pH ainsi que l’étude de la distribution spatiale insitu des composés par imagerie par spectrométrie de masse se révèlent prometteuses bien qu’elles n’aient pas, àce jour permis d’identifier le possible rôle de la bêtaprotéobactérie dans la biosynthèse de ces métabolites.

  • Titre traduit

    Bacteria associated to the Mediterranean sponge Crambe crambe : diversity and possible role in the biosynthesis of guanidine alkaloids


  • Résumé

    Crambe crambe (Schmidt, 1862), is a marine sponge widely distributed in the Mediterranean Sea and known toproduce bioactive guanidine alkaloids (crambescins and crambescidins). While the biosynthetic pathways ofthese metabolites remains unknown, bio-mimetic chemical synthesis of crambescidins suggested a possiblecontribution of microorganisms in their biosynthesis. Contrastingly, it had been reported via electron microscopythat bacteria were absent in the tissues of this sponge. Thus to shed light onto these contrasting results I studiedthe microbial community associated with C. crambe using alternative approaches. Using molecular andmicroscopic techniques, we demonstrated that a single bacterial species affiliated to the Betaproteobacteria ispresent in abundances commonly found in low microbial abundance sponges, and dominates the bacterialcommunity associated with C. crambe. This finding suggests a possible implication of bacteria the biosynthesisof C. crambe’s guanidine alkaloids. The use of acclimatization procedure and diverse cultivation approachesallowed the isolation of associated microorganisms which were rare or absent among the community describedvia tag pyrosequencing but not isolation of the dominant betaproteobacterium. CLHP/DAD/ELSD andCLHP/ESIMS fingerprints of extracts from C. crambe and from the isolated bacteria showed no evidence of theimplication of these cultured micro-organismes in the synthesis of C. crambe’s metabolites. Finally in order toevaluate the potential role of the uncultivated betaproteobacterial symbiont in the biosynthesis of guanidiniumalkaloids, preliminary experiments using two alternative approaches were attempted. In the first I subjectedsponges to a pH stress and evaluated changes in secondary metabolite profiles, while collecting samples formicrobial community analysis. In the second I tried different mass spectrometry imaging techniques to localizeguanidinium alkaloids in C. crambe tissues. While these experiments did not allow to resolve the question of apossible implication of the dominant betaproteobacterium in the biosynthesis of the pentacyclic guanidinealkaloids, I was able to gather interesting results that will guide future studies towards resolving this question.


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